简并引物设计的新手入门

互联网2013-09-06

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最近想用“简并引物 ”设计点实验做做，上网找了点东东，还是发现了不少东西。特总结如下：主要包括简并引物设计常用的几个方面及简并因为设计时的注意事项。

简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。密码子具有简并性，单以氨基酸顺序推测编码的DNA 序列是不精确的，但可以设计成对简并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用简并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。

简并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择简并性小的氨基酸，并避免引物3’末端简并，针对简并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。

为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度(1μM到3μM)，因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

同时，简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物.现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷(deoxyinosine;DI)引物进行PCR，可以代替编码蛋白的多种简并密码子中的简并碱基，DI的特异性主要受cDNA浓度影响。

简并引物的设计：

简并引物是根据某些特定的目的而选用的一组混合物，指在寡核甘酸的某一位置(一个简并位)上有多个碱基存在于不同的寡核甘酸分子中，如一组简并引物中有N1，N2，N3三个简并位，在N1上有三个碱基简并，N2二个，N3 四个，则此简并引物中共有undefinedundefined4=24种寡核甘酸分子。

简并引物常用的几个方面：

1.从已知蛋白到相关核酸分子的研究。

2.用一组引物扩增一类分子。

在上述两个主要应用中，需要注意的几个主要问题:

1. 从蛋白到核酸，应注意：

① ，尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子。

② ，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。

③ ，引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。

④ ，在简并度高的位置，可用次黄嘌呤(dI)代替简并碱基。

以上几点，遵循的总的原则为：尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。

2.用一对简并引物扩增一类DNA分子时，同样遵循上述总的原则，即尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。

在此种应用中，应先利用工具软件(多序列对准比较软件)或其它工具找到这些分子的保守区，然后根据共有序列，应用上面所述的一些原则来设计所需要的引物。