材料与仪器
pBSII KS 质粒 大肠杆菌 DH5α
Pfx 聚合酶 碱性磷酸酶 通用缓冲液 覆盖液 刚果红溶液 脱色液 桦木木聚糖底物溶液 PAHBAH 储液
Pfx 聚合酶 碱性磷酸酶 通用缓冲液 覆盖液 刚果红溶液 脱色液 桦木木聚糖底物溶液 PAHBAH 储液
步骤
我们以 DNA 重组 D.thermophilum Rt46B.1 木聚糖酶基因（ xynB) 及其 5 个相关的木聚糖酶基因为例 [7]，说明 DOGS 的一般流程。图 11.1 是整个实验的框架图。包括设计引物、引物延伸扩增出基因片段，然后整合这些片段，最后扩增出全长的嵌合基因（注 1)。
3.1 互补的简并引物对可以有效地扩增基因片段并且容易将有重叠的相邻片段连接起来
最常用的分离远缘关系基因的方法，是根据基因中高度保守的序列，设计出简并引物，然后通过 PCR 来分离这些基因。这个方法的难点是，随着引物简并性的增加以适合更多的基因，指导 PCR 反应合成的正确引物数则会降低，而且这些引物在反应最初的几个循环就有可能被用完。此时非特异性的扩增就会在大量的没有参与到目标基因扩增的引物存在下出现，尤其是在错配模板过程中采用不太严格的退火温度时。
为了克服简并寡核苷酸基因改组中简并引物存在的上述问题，Rose 等 [13] 发明了一种称为共识-简并寡核苷酸混合的方法（CODEHOP) 。CODEHOP 引物包含一个相对较短的简并 Y 端和一个通用的非简并 5' 端。3' 端长度减至最少可降低整个简并引物库中的引物数。简并的 3' 端与模板的结合可以通过非简并的 5' 端来稳定，这样就在不需要增加文库简并度的情况下允许更高的退火温度。虽然 5' 端与目标序列在最初的 PCR 循环中可发生潜在的错配，但它们离 3' 端延伸位点比较远，因此，错配很少影响聚合酶延伸的起始。基因产物的进一步扩增，通过引物池中引物序列的相似性，被显著增强；这也表明有更多的引物可被使用。DOGS 方法通过改进CODEHOP，可以更有效地扩增重叠区的基因片段。通过来自不同基因的相邻基因片段的重叠延伸可以导致嵌合基因的生成。合适的引物序列设计，是 DOGS 方法中最重要的一环。
对 CODEHOP 方法的改进，需要很好地设计互补引物对。每个引物有一个非简并的核心，两边是简并的 5' 端和 3' 端，在这里我们称其为互补简并端（CDE) 引物。同 CODEHOP 中的引物一样，简并的 3' 端使得 CDE 引物与模板可以特异的结合，而非简并区则可稳定接下来的 PCR 循环。简并的 5' 端在 PCR 过程中并不促成 CDE 引物与模板的结合，它主要是用来有效的结合并重叠延伸相互分离的、分别由正向或反向 CDE 引物扩增的 PCR产物（基因片段）。
每个 CDE 引物非简并的核心区通常是基于相应基因上的编码序列，该基因往往是用来混编的亲代基因。这可以保证嵌合的基因在重组的位点保留亲代基因的序列。
3.1.1 设计和使用基因特异的巢式末端引物
( 1 ) 设计和合成用来扩增每个需要混编基因的适合的正向和反向引物。每个引物应该包含 17〜20 个核苷酸基因特异性的 3' 端和包含 17〜20 个核苷酸的通用 5' 端。我们在通用端引物引入酶切位点，以便定向连接 PCR 产物到 pBSII KS 载体中。
( 2 ) 合成两个巢式引物，其序列相对于基因特异的正反向巢式引物通用端。该巢式引物将和 CDE 引物结合使用，以扩增每一基因的首末部分。
( 3 ) 用设计好的基因特异性引物扩增出每个基因，一般是从基因组中扩增，或者从其他有该基因的克隆中扩增。
3.1.2 CDE 引物特点总结
CDE 引物可以有效地扩增同源关系较小的基因中的片段。CDE 引物的 5' 的简并端确保了通过正向和反向互补的 CDE 引物扩增出来的基因片段在接下来的重叠延伸 PCR 步骤中可以有效地退火。而且，由多个 CDE 引物产生的连续基因片段带有适合重叠延伸和 PCR 的互补末端，从而可以产生重组的片段。图 11.2 给出了设计 CDE 引物的一个例子，以便从相关基因中扩增基因片段以及在后续叠加延伸片段中生成嵌合体。
CDE 引物也可以与不含有非简并核心区的互补简并引物结合使用，通过末端互补以及重叠延伸 PCR，从而得到重组的基因片段。将这些来自相关基因的片段混合后进行重叠延伸和 PCR，可以有效地产生嵌合的基因片段。 CDE 引物的非简并区可以（但不必须）根据一个亲代基因来设计。最后，来自不同基因的片段可以不等量的混合，这样可以控制不同片段整合产生的新基因（ 见注 2)。图 11.3 概括了用 CDE 引物扩增和重叠延伸基因片段的流程。
3.1.3 设计 CDE 引物以保证有效的基因片段的扩增和相邻片段的连接
( 1 ) 用合适的序列比对软件，如 ChistalX，对相关蛋白质进行序列比对。
( 2 ) 确定保守的氨基酸基序。在我们的例子中，木聚糖酶家族的基因根据其保守的区域可以分成 8 个部分。
( 3 ) 用合适的序列比对软件，如 Tranalign [ 15 ] ，对基因的核苷酸序列进行比对。
( 4 ) 基于保守的 DNA 序列，设计用以扩增保守位置 DNA 的 CDE 正向和反向引物。然后在适当地加入 5' 端和 3' 端的通用巢式引物的条件下，扩增出基因片段（图 11.2)。
( 5 ) 用相邻的 CDE 引物和通用的 5' 端和 3' 端巢式引物，扩增每个基因的每个片段。在这个例子中，PCR 反应的条件是：95°C 1 min，1 个循环；然后 95°C 30s，35°C 20s，72°C 40s，总共 35 个循环；最后 72°C 5 min，1 个循环。在 PCR 反应中使用的是古细菌 DNA 聚合酶，Platinum Pfx ( 见注3 和注4)。
( 6 ) 用胶回收每个 PCR 产物。
3.1.4 基因片段的重叠延伸
( 1 ) 每个基因的片段应当按合适的比例混合，产生基因的嵌合。例如，用 6 个候选的基因 G1〜G6，其中 G1 是 D .ZiermojiiZmn Rt46B.1 基因。当决定用 G1 在基因重组中作为主要的亲代基因时，每个基因的 PCR 片段则按照 8.75 倍的 G1 基因相对于等量的其他基因的比例混合，这样，嵌合基因中平均 5/8 的基因片段来自 Rt46B.1xynB ( 注 5 给出了一个简单的计算公式）。
( 2 ) 接下来，用 50〜100 ng 的混合片段作为模板来进行重叠延伸 [16]，应用如下的 PCR 反应体系：95°C 1 min，1 个循环；然后 95°C 30s，35°C 20s，72°C 40s，总共 35 个循环；最后 72°C 5 min，1 个循环。在 PCR 反应中使用的是古细菌 DNA 聚合酶，Platinum Pfx ( 见注 3)。
3.1.5 全长嵌合基因的扩增
将重叠延伸的产物（50〜100 ng，见 11.3.1.4 ) 作为模板，加入通用的 5' 端和 3' 端巢式引物，然后 PCR 便可得到全长的嵌合重组基因。PCR 的反应条件如下：95°C 1 min，1 个循环；然后 95°C 30s，50°C 20s，72°C 40s ，总共 35 个循环；最后 72°C 5 min，1 个循环。在 PCR 反应中用 Platinum Pfx 聚合酶。
3.1.6 重组基因的克隆
( 1 ) 用 Bam HI 和 Hind III 酶切 DOGS 的 PCR 产物。
( 2 ) 用 Bam HI 和 Hind III 酶切 pBSII KS-载体，然后用虾碱性磷酸酶处理。
( 3 ) 逢接 PCR 产物与载体 pBSII KS-。
( 4 ) 将连好的载体（载体上带有氨苄抗性）转入到的 DH5α 菌株中，然后涂在含有 100 μg/ml 氨苄抗性和 5 mmol/L IPTG 的 LB 平板上。
( 5 ) 挑取单克隆，在新的带有 100 μg/ml 氨苄抗性和 5 mmol/L IPTG 的 LB 平板上做一备份，然后按 11.3.1.7 节所描述的刚果红覆盖法（Congo Red Overlay ) [17] 来检测木聚糖酶的表达及活性。
3.1.7 刚果红筛选法
( 1 ) 将 4 ml 冷却至大约 50°C 的覆盖液加入到长有克隆的平板上。平板应该先在 37°C 预热以确保均匀的覆盖层的形成。
( 2 ) 当覆盖层形成后，将平盘倒置在一个封口袋内。在 70°C 密封放置 3 h。
( 3 ) 然后取出平板，去掉袋子，放置室温冷却。
( 4 ) 在每个平板上加入 5 ml 刚果红溶液，使其能全部覆盖覆盖层。然后放置 5~10 min。
( 5 ) 倒出剩余的刚果红溶液，然后将平板浸润在脱色液里脱色。
( 6 ) 未染上色的克隆是含有木聚糖酶基因阳性克隆。
图 11. 4 为用 DOGS 方法从 6 种木聚糖酶的基因中产生重组木聚糖酶的示例（见注 6)。
3.1.8 木聚糖酶活性测定（PAHBAH 方法）
使用蛋白质抽提试剂 BPER II，在全细胞中提取重组的木聚糖酶用来酶活分析。木聚糖酶的活性分析是用 Lever 法，以桦木木聚糖为底物测定的。终体积为 0.03 ml 的标准的反应混合液包括：120 mmol/L 的通用缓冲液（pH 6.5)[19]、0.5% ( m/V ) 木聚糖、还原酶。反应混合液在 60°C 放置 20 min。
1 ) 细胞裂解和酶的提取
( 1 ) 将鉴定为阳性转化株的在 2 ml 含有 100 μg/ml 氨苄和 IPTG 的 LB 中过夜培养。
( 2 ) 取出 1.5 ml 的过夜培养的 LB，11000 g 离心 30s，去掉上清液。
( 3 ) 通过振荡悬浮上述细胞，然后加入 150 μl 的 BPER II 溶液。
( 4 ) 振荡混匀 1 min，裂解细胞，11000 g 离心 1 min，去掉细胞碎片。
( 5 ) 将上清液转移到新的管中，然后在 4℃ 储存。
2 ) 木聚糖酶活性试验
( 1 ) 在 0.2 ml PCR 管中，将 5 μl 适当稀释的酶提取液加入到桦木木聚糖底物溶液中至终体积为 50 μl。
( 2 ) 将 PCR 管放在顶部能够加热的 PCR 仪中，在合适的温度下温育 10〜30 min。
( 3 ) 将 PCR 管放在冰水中，加入 PAHBAH 储液 100 μl 终止酶活反应，混匀。
( 4 ) 将上述混合液在 PCR 仪中 99°C 加热 5 min 进行变色反应。确保可加热的盖子置于关闭的位置。然后立即冷却到 4°C，以停止颜色的变化。
( 5 ) 将管中的溶液混匀，然后转移 100 μl 到平底的微孔板中。用具有合适的可读板的光谱仪检测在 A420 nm 的吸收值。
3.1 互补的简并引物对可以有效地扩增基因片段并且容易将有重叠的相邻片段连接起来
最常用的分离远缘关系基因的方法，是根据基因中高度保守的序列，设计出简并引物，然后通过 PCR 来分离这些基因。这个方法的难点是，随着引物简并性的增加以适合更多的基因，指导 PCR 反应合成的正确引物数则会降低，而且这些引物在反应最初的几个循环就有可能被用完。此时非特异性的扩增就会在大量的没有参与到目标基因扩增的引物存在下出现，尤其是在错配模板过程中采用不太严格的退火温度时。
为了克服简并寡核苷酸基因改组中简并引物存在的上述问题，Rose 等 [13] 发明了一种称为共识-简并寡核苷酸混合的方法（CODEHOP) 。CODEHOP 引物包含一个相对较短的简并 Y 端和一个通用的非简并 5' 端。3' 端长度减至最少可降低整个简并引物库中的引物数。简并的 3' 端与模板的结合可以通过非简并的 5' 端来稳定，这样就在不需要增加文库简并度的情况下允许更高的退火温度。虽然 5' 端与目标序列在最初的 PCR 循环中可发生潜在的错配，但它们离 3' 端延伸位点比较远，因此，错配很少影响聚合酶延伸的起始。基因产物的进一步扩增，通过引物池中引物序列的相似性，被显著增强；这也表明有更多的引物可被使用。DOGS 方法通过改进CODEHOP，可以更有效地扩增重叠区的基因片段。通过来自不同基因的相邻基因片段的重叠延伸可以导致嵌合基因的生成。合适的引物序列设计，是 DOGS 方法中最重要的一环。
对 CODEHOP 方法的改进，需要很好地设计互补引物对。每个引物有一个非简并的核心，两边是简并的 5' 端和 3' 端，在这里我们称其为互补简并端（CDE) 引物。同 CODEHOP 中的引物一样，简并的 3' 端使得 CDE 引物与模板可以特异的结合，而非简并区则可稳定接下来的 PCR 循环。简并的 5' 端在 PCR 过程中并不促成 CDE 引物与模板的结合，它主要是用来有效的结合并重叠延伸相互分离的、分别由正向或反向 CDE 引物扩增的 PCR产物（基因片段）。
每个 CDE 引物非简并的核心区通常是基于相应基因上的编码序列，该基因往往是用来混编的亲代基因。这可以保证嵌合的基因在重组的位点保留亲代基因的序列。
3.1.1 设计和使用基因特异的巢式末端引物
( 1 ) 设计和合成用来扩增每个需要混编基因的适合的正向和反向引物。每个引物应该包含 17〜20 个核苷酸基因特异性的 3' 端和包含 17〜20 个核苷酸的通用 5' 端。我们在通用端引物引入酶切位点，以便定向连接 PCR 产物到 pBSII KS 载体中。
( 2 ) 合成两个巢式引物，其序列相对于基因特异的正反向巢式引物通用端。该巢式引物将和 CDE 引物结合使用，以扩增每一基因的首末部分。
( 3 ) 用设计好的基因特异性引物扩增出每个基因，一般是从基因组中扩增，或者从其他有该基因的克隆中扩增。
3.1.2 CDE 引物特点总结
CDE 引物可以有效地扩增同源关系较小的基因中的片段。CDE 引物的 5' 的简并端确保了通过正向和反向互补的 CDE 引物扩增出来的基因片段在接下来的重叠延伸 PCR 步骤中可以有效地退火。而且，由多个 CDE 引物产生的连续基因片段带有适合重叠延伸和 PCR 的互补末端，从而可以产生重组的片段。图 11.2 给出了设计 CDE 引物的一个例子，以便从相关基因中扩增基因片段以及在后续叠加延伸片段中生成嵌合体。
CDE 引物也可以与不含有非简并核心区的互补简并引物结合使用，通过末端互补以及重叠延伸 PCR，从而得到重组的基因片段。将这些来自相关基因的片段混合后进行重叠延伸和 PCR，可以有效地产生嵌合的基因片段。 CDE 引物的非简并区可以（但不必须）根据一个亲代基因来设计。最后，来自不同基因的片段可以不等量的混合，这样可以控制不同片段整合产生的新基因（ 见注 2)。图 11.3 概括了用 CDE 引物扩增和重叠延伸基因片段的流程。
3.1.3 设计 CDE 引物以保证有效的基因片段的扩增和相邻片段的连接
( 1 ) 用合适的序列比对软件，如 ChistalX，对相关蛋白质进行序列比对。
( 2 ) 确定保守的氨基酸基序。在我们的例子中，木聚糖酶家族的基因根据其保守的区域可以分成 8 个部分。
( 3 ) 用合适的序列比对软件，如 Tranalign [ 15 ] ，对基因的核苷酸序列进行比对。
( 4 ) 基于保守的 DNA 序列，设计用以扩增保守位置 DNA 的 CDE 正向和反向引物。然后在适当地加入 5' 端和 3' 端的通用巢式引物的条件下，扩增出基因片段（图 11.2)。
( 5 ) 用相邻的 CDE 引物和通用的 5' 端和 3' 端巢式引物，扩增每个基因的每个片段。在这个例子中，PCR 反应的条件是：95°C 1 min，1 个循环；然后 95°C 30s，35°C 20s，72°C 40s，总共 35 个循环；最后 72°C 5 min，1 个循环。在 PCR 反应中使用的是古细菌 DNA 聚合酶，Platinum Pfx ( 见注3 和注4)。
( 6 ) 用胶回收每个 PCR 产物。
3.1.4 基因片段的重叠延伸
( 1 ) 每个基因的片段应当按合适的比例混合，产生基因的嵌合。例如，用 6 个候选的基因 G1〜G6，其中 G1 是 D .ZiermojiiZmn Rt46B.1 基因。当决定用 G1 在基因重组中作为主要的亲代基因时，每个基因的 PCR 片段则按照 8.75 倍的 G1 基因相对于等量的其他基因的比例混合，这样，嵌合基因中平均 5/8 的基因片段来自 Rt46B.1xynB ( 注 5 给出了一个简单的计算公式）。
( 2 ) 接下来，用 50〜100 ng 的混合片段作为模板来进行重叠延伸 [16]，应用如下的 PCR 反应体系：95°C 1 min，1 个循环；然后 95°C 30s，35°C 20s，72°C 40s，总共 35 个循环；最后 72°C 5 min，1 个循环。在 PCR 反应中使用的是古细菌 DNA 聚合酶，Platinum Pfx ( 见注 3)。
3.1.5 全长嵌合基因的扩增
将重叠延伸的产物（50〜100 ng，见 11.3.1.4 ) 作为模板，加入通用的 5' 端和 3' 端巢式引物，然后 PCR 便可得到全长的嵌合重组基因。PCR 的反应条件如下：95°C 1 min，1 个循环；然后 95°C 30s，50°C 20s，72°C 40s ，总共 35 个循环；最后 72°C 5 min，1 个循环。在 PCR 反应中用 Platinum Pfx 聚合酶。
3.1.6 重组基因的克隆
( 1 ) 用 Bam HI 和 Hind III 酶切 DOGS 的 PCR 产物。
( 2 ) 用 Bam HI 和 Hind III 酶切 pBSII KS-载体，然后用虾碱性磷酸酶处理。
( 3 ) 逢接 PCR 产物与载体 pBSII KS-。
( 4 ) 将连好的载体（载体上带有氨苄抗性）转入到的 DH5α 菌株中，然后涂在含有 100 μg/ml 氨苄抗性和 5 mmol/L IPTG 的 LB 平板上。
( 5 ) 挑取单克隆，在新的带有 100 μg/ml 氨苄抗性和 5 mmol/L IPTG 的 LB 平板上做一备份，然后按 11.3.1.7 节所描述的刚果红覆盖法（Congo Red Overlay ) [17] 来检测木聚糖酶的表达及活性。
3.1.7 刚果红筛选法
( 1 ) 将 4 ml 冷却至大约 50°C 的覆盖液加入到长有克隆的平板上。平板应该先在 37°C 预热以确保均匀的覆盖层的形成。
( 2 ) 当覆盖层形成后，将平盘倒置在一个封口袋内。在 70°C 密封放置 3 h。
( 3 ) 然后取出平板，去掉袋子，放置室温冷却。
( 4 ) 在每个平板上加入 5 ml 刚果红溶液，使其能全部覆盖覆盖层。然后放置 5~10 min。
( 5 ) 倒出剩余的刚果红溶液，然后将平板浸润在脱色液里脱色。
( 6 ) 未染上色的克隆是含有木聚糖酶基因阳性克隆。
图 11. 4 为用 DOGS 方法从 6 种木聚糖酶的基因中产生重组木聚糖酶的示例（见注 6)。
3.1.8 木聚糖酶活性测定（PAHBAH 方法）
使用蛋白质抽提试剂 BPER II，在全细胞中提取重组的木聚糖酶用来酶活分析。木聚糖酶的活性分析是用 Lever 法，以桦木木聚糖为底物测定的。终体积为 0.03 ml 的标准的反应混合液包括：120 mmol/L 的通用缓冲液（pH 6.5)[19]、0.5% ( m/V ) 木聚糖、还原酶。反应混合液在 60°C 放置 20 min。
1 ) 细胞裂解和酶的提取
( 1 ) 将鉴定为阳性转化株的在 2 ml 含有 100 μg/ml 氨苄和 IPTG 的 LB 中过夜培养。
( 2 ) 取出 1.5 ml 的过夜培养的 LB，11000 g 离心 30s，去掉上清液。
( 3 ) 通过振荡悬浮上述细胞，然后加入 150 μl 的 BPER II 溶液。
( 4 ) 振荡混匀 1 min，裂解细胞，11000 g 离心 1 min，去掉细胞碎片。
( 5 ) 将上清液转移到新的管中，然后在 4℃ 储存。
2 ) 木聚糖酶活性试验
( 1 ) 在 0.2 ml PCR 管中，将 5 μl 适当稀释的酶提取液加入到桦木木聚糖底物溶液中至终体积为 50 μl。
( 2 ) 将 PCR 管放在顶部能够加热的 PCR 仪中，在合适的温度下温育 10〜30 min。
( 3 ) 将 PCR 管放在冰水中，加入 PAHBAH 储液 100 μl 终止酶活反应，混匀。
( 4 ) 将上述混合液在 PCR 仪中 99°C 加热 5 min 进行变色反应。确保可加热的盖子置于关闭的位置。然后立即冷却到 4°C，以停止颜色的变化。
( 5 ) 将管中的溶液混匀，然后转移 100 μl 到平底的微孔板中。用具有合适的可读板的光谱仪检测在 A420 nm 的吸收值。
来源：丁香实验
