血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳

相关专题

 

【目的】
　　1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。
2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。
【原理】
带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点大多在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲液中均带负电荷，在电场中都向正极移动。由于血清中各种蛋白质的等电点不同，因此在同一pH环境中所带负电荷多少不同，又由于其分子 大小不同，所以在电场中泳动速度也不同。分子小而带电荷多者，泳动速度较快；反之，则泳动速度较慢。因此通过电泳可将血清蛋白质分为5条区带，从正极端依次分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白等，经染色可计算出各蛋白质含量的百分数。
醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便 、分辨率高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同工酶的分离和测定。
【器材】
　 醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（可用盖玻片或X胶片或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、试管、试管架、吸管、电泳仪 、电泳槽、分光光度计或吸光度扫描计。
【试剂】
　 1. 巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06) 称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。
2. 氨基黑10B染色液 称取氨基黑10B 0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏水至100ml。
3. 漂洗液 甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏水至100ml。
4. 洗脱液 0.4mol／LNaOH溶液。
5. 透明液 称取柠檬酸21g，N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解并稀释至500ml。
　 【操作】
1. 准备 将缓冲液加入电泳槽 的两槽内，并使两侧的液面等高。裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即 “滤纸桥”（图3-1）。

将醋酸纤维素薄膜切成2cm×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向下，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待充分浸透（约20分钟）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。
2. 点样 取少量血清于玻璃板上，用加样器取少量血清(约2～3μl)，加在点样线上，待血清渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均匀的直线，并避免弄破薄膜（图3-2）。