醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白

[目的与原理] 掌握醋酸纤维素薄膜电泳原理及操作技术，利用该电泳技术分析和测定人或鱼血清中各种蛋白质相对百分含量。

醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。

本实验以醋酸纤维素为支持物，分离各种血清蛋白，血清中含有清蛋白，α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同（表1-2-8），在电场中迁移速度不同，分子量小、等电点低、在相同碱性pH缓冲系统中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快

例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白（如图1-2-7）。这些区带经洗脱后可用分光光度计法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单、快速、分辨率高及重复性好等优点。目前，以成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于分离血清蛋白，还可以分离脂蛋白，血红蛋白及同工酶的分离测定。

图1-2-7正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图

1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样原点

[试剂与器材]

试剂：

1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，备用。

2、血清蛋白染色

（1）染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存。

（2）漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存。

（3）透明液：临用前配制。

甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。

乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。

（4）保存液：液体石蜡。

（5）定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。

材料：未溶血的人或动物血清

器材： 醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）

[实验步骤]

1、电泳槽与薄膜的制备

（1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择：用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s—30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。

（2）电泳槽的准备：根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素膜的桥梁，因而称为滤纸桥。

2、点样

用钝头镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液，无光泽面向上平放在点样板上，点样时用点样器沾少许血清，再将点样器轻轻印在点样区内，样品线长度一般为1.5cm，宽度一般不超过3mm如图1-2-8所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线，此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后在正式点样。

图1-2-8，醋酸纤维素薄膜规格及点样位置虚线处为点样位置

3、电泳

用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。如图1-2-9所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。

用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。通电10min—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50min—60min。电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。

图1-2-9 醋酸纤维素薄膜装置示意图

4、染色与漂洗

用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5％氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。

5、透明

将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡。约2min—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。

6、定量

（1）浸泡 将膜片上的各蛋白质分离区带分段剪下，分别置于相应的标有编号的试管内，然后各加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液进行浸泡。浸泡淡色带所加入的0.4mol/L氢氧化钠溶液的量为4ml，深色带为8ml（此时的稀释倍数是淡色带的2倍）。室温下的浸泡时间为30min～60min。若在37℃水浴中浸泡，则为10min～15min。浸泡期间振荡数次，使蛋白质区带浸出。另外再剪取与色带膜条大小相同的无色带膜条作为空白，以相同的方式浸泡在0.4mol/L氢氧化钠溶液中。

（2）比色 浸泡完毕，将浸出的有色溶液在分光光度计上进行比色测定。测定波长为620nm，光径为1cm。若浸出液有混浊或沉淀，则以4000r/min的转速离心10min～20min除去，然后再取上清液进行比色测定。

（3）计算 比色测定结束后，各组分的含量按下式计算： 某蛋白质组分百分含量＝某蛋白质组分的光吸收值/样品中各蛋白质组分的光吸收值总和×100％

上式中深色带蛋白质组分的光吸收值应乘以稀释倍数2，例如血清白蛋白组分的分离区带为深色带，浸泡时所加入的0.4mol/L氢氧化钠的量是其它淡色带的2倍，所以应乘以2。

[方法评估]
1、醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点
（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。
（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
（3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
（4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。

[应用意义] 由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。目前已广泛用于检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而成为医学和临床检验的常规技术。

[注意事项]
1、醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s—30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。

2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。

3、加样量
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1μl，相当于60μg—80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。

4、电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。

5、染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。

6、透明及保存
透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易平展。