生物化学技术-生物大分子制备技术

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生物大分子 ：蛋白质(包括酶)和核酸。

在当前迅速发展的现代生物学中，主要的研究方向就是以核酸和蛋白质的结构 与功能为基础，从分子水平去认识生命现象。因此，得到高纯度具有生物活性的目的物质成为一切研究的首位。

生物大分子的制备工作涉及物理、化学、生物等多学科知识。但总的来说就是：

1、 利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中。如：盐析、层析、结晶和有机溶剂提取等。

2、将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离目的。如：电泳、梯度密度离心、超滤等。

注意：不管采取什么方法必须保持生物大分子的完整性和分子的生物活性。

生物大分子的制备步骤：

1、 选择材料和预处理

2、 细胞破碎和细胞器 分离

3、 提取、纯化与浓缩

4、干燥与保存

一、 选择材料与预处理

微生 微生物材料：1、利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶2、利用微生物体含有的生化物质：蛋白质、核酸和胞内酶等。

使用微生物作为提取材料时要注意它的生长期。因为，在它达到对数生长期时，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。

植物材料：利用材料的根、茎、叶、果实等部分提取其中的生物活性物质。

使用植物作为提取材料时要注意它的品种、生长地域、季节、气候条件等，甚至采摘的时间段都要考虑。

动物材料：利用动物的脏器或组织提取有效成分。主要是选择有效成分含量丰富的部分。动物材料一般要进行绞碎、脱脂等处理。

上述处理后的材料，若不立即进行试验应冷冻保存!而对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

二、细胞的破碎与细胞器的分离

(一) 细胞的破碎

1、 高速组织捣碎机

将材料配置成稀糊状液，放置于捣碎杯内1/3体积，旋紧杯盖。将调速器慢慢启动逐渐调至所需转速。或采用间歇方式进行。此方法适于动物内脏组织和植物肉质种子等。

2、 玻璃匀浆器

将剪碎的组织放入匀浆器管中，插入研杵来回研磨，利用管内和研杵的磨砂部分将组织细胞破碎。此方法适用于动物内脏和植物组织较嫩部分等。适合处理较少量的细胞破碎。其细胞破碎程度高于组织捣碎机。

3、超声波处理法

使用一定功率的超声波对细胞悬浊液进行处理，使细胞急剧震荡破碎。此法多用于微生物材料，如用大肠杆菌制备各种酶。此方法的缺点在于处理材料时会产生大量的热量，应注意降温。而对于超声波敏感的酶和核酸要慎用此法。

采用此法时选用菌体质量浓度为50—100mg/ml,在10—100KHZ下，处理10—15分钟。

4、反复冻融法

将细胞在-20℃以下冰冻，室温解冻。反复几次。此时由于细胞内的水分形成冰粒和剩余细胞液的盐浓度增加引起溶胀，使细胞结构破碎。常用于细菌的破壁和一些植物材料。

5、化学处理法

在细胞液中加入一定试剂，使其细胞膜破坏的方法。如：肿瘤细胞常采用加入SDS或去氧胆酸钠等破坏细胞膜使胞内物释放。细菌的细胞壁较厚常采用溶菌酶破壁。

(二)细胞器的分离

各类生物大分子在细胞内的分布不同。如：DNA几乎全在细胞核内;RNA主要在细胞浆中。各种酶在细胞中也有特定的位置，因此，要根据目的物质的存在位置选取提取材料。

蛋白质、酶、核酸在肝细胞中的分布情况

细胞器名称 主 要 蛋 白 质 及 酶 核 酸

细胞核

线粒体

内质网(微粒体)

溶酶体

高尔基体

细胞膜

细胞液 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系

参与电子传递、氧化磷酸化、脂肪酸氧化、

TCA、氨基酸氧化的酶系及脲合成酶系

蛋白质合成酶系、羟化酶类

水解酶系

糖苷转移酶、粘多糖、类固醇合成酶系

载体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、

环化脲苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶

嘧啶与嘌呤代谢酶系、氨基酸合成酶系、

可溶性蛋白类 全部DNA

总RNA的10%

微量DNA

总RNA的5-10%

总RNA的50%

总RNA的30%

(主要是tRNA)

细胞器的分离一般采用差速离心法。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管的不同区域，分离后得到所需组分。常用于分离细胞器的介质：蔗糖、氯化铯、葡萄糖、聚乙二醇等。

三、 提取与纯化

提取——经过或破碎的细胞，置于一定条件的溶液中，使被提取的生物大分子充分释放出来的过程。

影响提取的因素：被提取物质在提取溶液中溶解度的大小;由固相扩散到液相的难易程度。

物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂的理化性质有关。一般遵守：“相似相溶”的原则。对提取生物大分子，减小溶剂粘度、搅拌和延长提取时间可提高扩散速度，提高提取效率。提取采用“少量多次”效果较好。

(一)蛋白质(酶)的提取

大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸和稀碱溶液。少数与脂结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂。因此，要采取不同的溶剂提取、分离和纯化蛋白质及酶。

1、水溶液

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质的稳定性好、溶解度高，是提取蛋白质的常用溶剂。

溶剂用量：一般为原材料体积的1—5倍;

提取温度：视被提取物质的性质而定。(蛋白质溶解度随温度生高而增大，但温度过高会使蛋白质变性失活。提取蛋白质和酶常采用低温(5℃以下)操作;

提取条件：要均匀搅拌，加快扩散速度;

提取液的pH值：选择偏离蛋白质或酶等电点两侧的pH值范围;防止过酸或过碱引起蛋白质可解离基团发生变化，导致蛋白质构象的不可逆改变。一般碱性蛋白质使用偏酸性提取溶剂、酸性蛋白质使用偏碱性提取溶剂。

稀盐提取液的浓度：稀盐溶液可促进蛋白质的溶解，即盐溶作用。同时，稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。因此，在提取液中加入少量的NaCl等中性盐一般以0.15mol•L-1浓度为宜。缓冲溶液常用0.02—0.05 mol•L-1磷酸盐或碳酸盐溶液。

2、有机溶液

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水，稀酸、稀碱和稀盐溶液，可采用乙醇、丁醇或丙酮等有机溶剂提取。它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白提取液。但提取时一定要在低温下进行。

丁醇对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越：丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强;它具有亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活;此法温度和pH值的选择范围广，适用与所有的生物材料。

(二)蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化的方法很多，主要有：根据蛋白质的溶解度不同;根据蛋白质分子大小差别;根据蛋白质带电情况;根据蛋白质配体的特异性差异等。

1、根据蛋白质溶解度不同的分离方法：

(1)蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响。一般在低盐浓度下随盐浓度的升高，蛋白质溶解度增加称为盐溶。随盐年度继续增大时，蛋白质溶解度不同程度的下降并先后析出，这种现象称为盐析。

高浓度的盐离子(如：(NH4)2SO4的SO4-2和NH4+)有很强的水化作用，可夺取蛋白质的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

进行盐析时，如溶液的pH值在蛋白质的等电点则效果更佳。

蛋白质分子的大小不同、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同。因此，可通过调节蛋白质溶液的中性盐浓度，使之分段沉淀。

血浆蛋白的分段盐析

硫酸铵的饱和度 沉淀的主要蛋白质 占血浆总蛋白

g.(100mlH2O) 的质量分数，%

20 纤维蛋白 4

33—48 优球蛋白 3

40—46 假球蛋白 24

>50 清蛋白 69

影响盐析的因素：

a、 温度：除对温度较敏感的蛋白质在低温下(4℃)操作外，一般可在室温下进行。

b、 pH值：大多数蛋白质在等电点的浓盐溶液中溶解度最低。

c、 蛋白质浓度：一般蛋白质溶液含量掌握在25—30g•L-1。

蛋白质盐析常用的中性盐：

硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵。它具有溶解度的温度系数小(25℃，4.1mol•L-1;0℃，3.9 mol•L-1)而溶解度大;分段盐析比其它盐效果好;不易引起蛋白质的变性。

硫酸铵溶液的pH值在4.5—5.5之间，当需要超出时，可用硫酸和氨水调节。

盐析沉淀后的蛋白质要除去其中的盐，常用透析(时间长，要低温)和葡聚糖凝胶(G-25或G-50)层析柱来处理(时间短)。

(2)等电点沉淀法

蛋白质在电中性时，其静电斥力最小，溶解度最小形成颗粒沉淀出来。由于各种蛋白质的等电点不同，可利用调节溶液的pH值达到某一蛋白质的等电点使之沉淀进行分离。此法多与盐析法结合使用。

(3)低温有机溶剂沉淀法

与水相溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮等)可使多数蛋白质溶解度降低并析出。

此法分离效率比盐析高，但蛋白质容易变性，应在低温下进行。

2、根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

(1)透析与超滤

透析法是利用半透膜将大小不同的蛋白质分子分开。超滤法是利用高压力或离心力，使水和其它小的溶质分子通过半透膜而蛋白质留在膜上。选择不同孔径的滤膜截留不同相对分子质量的蛋白质。

(2)凝胶过滤法(分子排阻层析法或分子筛层析)

这是根据分子大小分离蛋白质混合物的有效方法之一。主要填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。

3、根据蛋白质带电性质进行分离

根据蛋白质在不同的pH环境中带电性质和电荷数量不同将其分开。

(1)电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下，因相对分子质量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同得以分开。

在电泳中等电聚焦电泳比较重要。它主要是利用一种两性电解质作为载体。电泳时两性电解质形成一个从正向负极逐渐增加的pH剃度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点pH位置就停止。

此法可用于分析和制备各种蛋白质。

(2)离子交换层析法

阳离子交换剂：羟甲基纤维素;阴离子交换剂：二乙氨基乙基纤维素。

当被分离蛋白质溶液流经阳离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后用改变pH或离子强度的方法将吸附的蛋白质从柱上洗脱下来。

4、根据配体特异性的分离方法—亲和层析法

亲和层析法是分离蛋白质的一种非常有效的方法。它通常需要一步处理即可使某种待提纯分离的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来。而且纯度很高。

此法根据某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。如：酶—辅酶、抗原—抗体、激素—受体等。其原理：先把待提纯的目的蛋白的配体共价连接到琼脂滩一类的多糖表面的功能团上，当混合蛋白流经层析柱时，待提纯的蛋白与特异的配体结合而吸附在层析柱上，其他杂蛋白流出，最后将与配体结合的特异蛋白洗脱下来。

蛋白质在组织和细胞中是以复杂的混合形式存在。每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、提纯和鉴定是生物化学中的重要部分。至今还未有一种单独或一套现成方法可把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来。往往需要几种方法的联合使用。

(三)核酸的提取

核酸都溶于水，不溶于有机溶剂。因此，利用此性质进行提取。在细胞中，DNA以DNP、RNA以RNP形式存在，在不同浓度的盐溶液中它们的溶解度差别很大。如：DNP在纯水或1 mol•L-1NaCl中溶解度较大，但在0.14 mol•L-1NaCl中溶解度很低。相反，RNP却易溶解。因此，利用0.14 mol•L-1NaCl溶液可以简单的将DNP与RNP分开。

分离核酸时最困难的是将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸降解。

常用的解离剂是阴离子去污剂：脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、4-氨基水杨酸钠和萘-1，5二磺酸钠。它们具有溶解病毒、细菌的作用，可使核酸从蛋白质上游离出来。并且还具有抑制核糖核酸酶的作用。

除去核酸中蛋白质的有效方法是用酚—氯仿混合液，它可使蛋白质变性并对核酸酶有抑制作用，氯仿的比重大可使有机相与水相完全分开减少在水相中的酚。

操作时需要剧烈震荡。

为防止起泡和促使水相与有机相分离，可在酚—氯仿抽提液中加入一定量的异戊醇。

组织细胞破碎后，加入0.5mol•L-1NaCl溶液，离心去上请液→沉淀用1.0mol•L-1NaCl溶液溶解→用酚—氯仿混合液震荡抽提→离心，取水相→加入2倍体积的乙醇沉淀DNA。

在提取DNA的溶液中加入EDTA(乙二胺四乙酸)金属螯合剂，以除去Ca+2、Mg+2，抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，减少对DNA的降解。而DNA中少量的RNA可用纯核糖核酸酶(RNase)水解除去。

2、RNA的提取

提取中的关键在于防止RNase的降解作用。许多试剂中和手指上都有此酶，所以要特别注意。一般常用：a、低温操作(4℃)b、所用器械、器皿高温消毒，试剂中加入RNase抑制剂c、操作时带手套。

细胞中含有mRNA、tRNA、rRNA不易分离。可将细胞匀浆液进行差速离心，得到细胞核、线粒体和核糖体等，然后再从这些细胞器中分离某一类RNA。

(四)核酸的纯化

核酸纯化的关键步骤是除去蛋白质。通常只要用酚—氯仿、氯仿提取核酸水溶液即可。

用酚—氯仿混合液比单独用酚除蛋白效果更佳。然后再用氯仿抽提可除去核酸制品中的痕量酚。

步骤：1、核酸样品置于有盖小离心管中，加入等体积酚—氯仿→2、旋涡混匀管内物，呈乳状→3、12000g，室温离心15S→4、水相移入另一离心管中，弃去两相界面和有机相→5、重复上述步骤直至两相界面无蛋白质→6、加入等体积氯仿并重复2—4步骤→7、浓缩、沉淀，回收核酸。

(五)核酸的浓缩

应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后可形成的核酸沉淀可经离心回收。此法对Pg(皮克，10-12g)量的DNA或RNA，也可定量回收。再按所需浓度溶于适当缓冲溶液中。

操作步骤：先向含有样品的小离心管中加入V/10的单价阳离子贮存液，2V无水乙醇，混匀。放入冰水浴中15—30min，取出后目测平衡，0—4℃，12000g离心10min。弃上清。加入70%乙醇溶液0.5—1ml，0—4℃，12000g离心2min。弃上清，沉淀用油泵抽干或打开离心管盖子凉干，溶于适当体积缓冲液。

(六)DNA、RNA的定量

准确的方法是紫外分光光度法。但此法要求核酸样品纯净，其中不应含有蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物。

用紫外分光光度计测定260nm和280nm两处的吸光度值。然后按1A260相当于50ug•ml-1双链DNA;40 ug•ml-1单链DNA或RNA;20 ug•ml-1单链寡核苷酸计算样品核酸含量。A260/ A280反映样品核酸的纯度。DNA纯品其比值为1.8，RNA纯品比值为2.0。样品中含有蛋白质或酚污染，其比值低于此数。

(七)核酸的凝胶电泳和相对分子量参照物

1、 琼脂糖凝胶电泳

常用于分离、鉴定、提纯DNA片段。

本方法操作简单、迅速 能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物。分开的DNA片段可用低质量的的荧光染料(0.5 ug•ml-1溴化乙锭)染色，在紫外灯下直接观察。可检测少到1ng的DNA。

DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于：a、DNA分子大小;线状DNA分子通过凝胶的速率与其相对分子质量的常用对数成反比。利用已知相对分子质量的标准物质与待测相对分子质量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出其分子大小。b、琼脂糖浓度：利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛、大小不同的DNA片段。

不同质量浓度可分离线状DNA分子的范围

琼脂糖凝胶质量范围 分离线状DNA分子的范围

g•L-1 Kb

3 5—60

6 1—20

7 0.8—10

9 0.5—7

12 0.4—6

15 0.2—3

20 0.1—2

C、DNA的构型：相同相对分子质量的闭环(Ⅰ型)、开环(Ⅱ型)和线形(Ⅲ型)DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下其迁移率：Ⅰ型〉Ⅲ型〉Ⅱ型。d、应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成反比。在电压增加时，相对分子质量大的DNA片段迁移率增大不同。因此，琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨率，电泳时，电压不应超过5V•cm-1。

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳

此法适用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段。

有效分离范围

凝胶质量浓度g•L-1 有效分离范围 bp

35 100—1000

50 80—500

80 60—400

120 40—200

200 10—100

聚丙烯酰胺凝胶电泳多用于垂直板电泳和圆盘电泳。

不同浓度聚丙烯酰胺凝胶配置表

试 不同质量浓度g•L-1凝胶所用试剂ml数

剂 35 50 80 120 200

30%单体母液 11.6 16.6 26.6 40 66.6

H2O 76.3 71.3 61.3 47.9 21.3

3%过硫酸铵 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1

10×TBE 10 10 10 10 10

总体积 100 100 100 100 100

30%单体母液：29g丙烯酰胺，1g双丙烯酰胺加水溶解，定容到100ml。

10×TBE：每升含Tris(二羟甲基氨基甲烷)108g;硼酸55 g和EDTA(乙二胺四乙酸)

40ml，0.5mol•L-1(pH 8.0)

总体积可根据各组分比例按具体使用情况配置。

具体步骤：将上述配置的液体100ml加入30ul四甲基乙二胺(TEMED)混匀后，可灌注预先准备好的洁净不渗漏的凝胶玻板。待凝胶灌至顶端时，立即插入“梳子”，室温聚合60min(冬季室稳较低可放入37℃温箱中)，聚合完成后拔出“梳子”，将胶板固定于电泳槽中，加入1×TBE，用滴管冲洗加样孔和凝胶底部除去气泡，即可加样电泳。圆盘电泳则将凝胶灌入玻璃管。一般所用电压为1—8•cm-1，随时观察标记染料(1%溴酚蓝)的迁移。电泳结束，从电泳槽上取出玻板并小心撬开，凝胶片浸于溴化乙锭液 (0.5ug•ml-1的1×TBE溶液)染色45min后，于紫外灯下观察结果。

3、相对分子质量参照物

为判断目的DNA片段的大小，常在目的DNA的旁边加一相对分子质量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的DNA片段的大小。常用参照物：λHindⅢ消化物，其各片段大小(bp)：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。

四、浓缩、干燥及保存

(一)样品浓缩

生物大分子溶液在制备过程中由于过柱纯化时变的很稀，为了保存和鉴定的目的，需要进行浓缩。

1、减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低。减压的真空度愈高液体沸点愈低，蒸发愈快。此法适合不耐热的生物大分子浓缩。

2、空气流动蒸发浓缩

空气流动可使液体加速蒸发。将铺成薄膜的液体表面不断通过空气流。或将样品溶液装入透析袋，置于冷室，用电扇对准吹风，使透析膜外溶剂不断蒸发达到浓缩目的。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液处理。

3、冰冻法

生物大分子溶液在低温下结成冰, 盐类和生物大分子不能进入冰内而留在未结冰的液相中。操作时，先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢融解，利用溶剂与溶质融解点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如：蛋白质或酶的盐溶液浓缩。

4、吸收法

通过吸收剂直接吸收除去溶剂分子使之浓缩。此法要求吸收剂与溶剂不起化学反应，对生物大分子不吸附，并吸收剂与溶液移分开。常用的吸收剂：聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝胶等。

5、超滤法

使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性的过滤。当溶液在一定压力下(氮气加压或真空负压)通过膜，溶剂和小分子透过而大分子受阻保留。此法是近年发展的新方法应用较广，对蛋白质和酶溶液的浓缩、脱盐具有成本低、操作方便、条件温和、较好的保持生物大分子活性及回收率高等优点。

(二)干燥

真空干燥：适用于不耐高温、易于氧化物质的干燥和保存。装置包括：干燥器、冷凝器和真空泵。干燥剂常用：P2O5、CaCl(无水)、变色硅胶等。

冷冻干燥：除利用真空原理外，还增加温度因素。此法是在低温低压下使冰升华变成气体而除去。产品具有疏松、溶解度好和保持天然结构等优点。

(三)保存

生物大分子的稳定性与保存方法有很大关系。干燥制品一般比较稳定。在低温情况下其活性可在数月甚至数年无明显变化。贮藏要求简单，只将样品于干燥器内(加干燥剂)密封，保存在0—4℃冰箱中即可。

液氮贮藏可免除繁杂的干燥过程，且生物大分子的活性和结构不易破坏。

进行保存要注意：

1、样品溶液不能太稀，太稀易变性。必须浓缩到一定程度才可封装贮藏。

2、一般要加入防腐剂和稳定剂。防腐剂：甲苯、苯甲酸、氯仿、白里酚等。稳定剂：硫酸铵糊、蔗糖、甘油等。核酸一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。

3、贮存温度要低。大多数在0℃左右的冰箱中。有的要求更低的温度。，视情况而定。