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实验动物生物材料采集和制备实验

相关实验:实验动物生物材料采集和制备实验

最新修订时间:

材料与仪器

成年小鼠 大鼠 家兔
肝素生理盐水溶液 PBS 缓冲液
家兔盒 兔固定架 大小鼠固定板 大剪刀 镊子 儿科小骨钳 离心管 玻璃毛细管 注射器 吸管 滴管 匀浆机 培养皿 离心机 搅拌机 大小鼠代谢笼

步骤

一、试剂和材料

(一)实验动物:成年小鼠、大鼠和家兔。

(二)器材

1、家兔盒,兔固定架,大小鼠固定板。

2、解剖器材大剪刀,镊子,儿科小骨钳。

3、其他器材离心管(2-10ml),玻璃毛细管(内径1-1.5ml),注射器(1,2,5 和10ml)及相应针头,吸管(5-10ml),滴管,匀浆机,培养皿(直径5-10ml)。

4、仪器设备离心机(4000r/min),搅拌机(2000r/min),大小鼠代谢笼。动物称,电子天平。

(三)试剂

1、抗凝剂0.5%肝素生理盐水溶液。

2、生理盐水或PBS 缓冲液。

(四)其他

碘酒、酒精棉球、滤纸。

二、操作步骤

(一)血液的采集

1、大鼠与小鼠的采血方法:

① 鼠尾采血:当所需血量很少时采用本法。固定动物并露出鼠尾,将尾部浸入45~50℃温水中数分钟,使尾静脉充血,擦干,再用酒精棉球擦试消毒。剪掉尾尖(约0.2~0.3cm),拭去第一滴血。然后用血色素吸管定量吸取尾血,或将尾血直接滴入容器内。采血完毕用干棉球压迫止血。亦可不剪尾,用7~8 号注射针头连上注射器直接刺破尾静脉采血。

② 眼眶静脉丛采血:当需用中等量的血液,而又避免动物死亡时采用本法。左手拇指及食指紧紧握住大鼠或小鼠颈部,压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血,但用力要恰当,防止动物窒息死亡。右手持玻璃毛细管从右眼或左眼内眦部以45°角刺入,刺入深度小鼠约2~3mm, 大鼠4~5mm。若遇阻力稍后退调整角度后再刺入,如穿刺适当,血液能自然流入毛细管内。

得到所需的血量后,即除去加于颈部的压力,拔出毛细管,用干棉球压迫止血。

③断头采血:当需用较大量的血液,而又不需继续保存动物生命时采用本法。左手握住动物,右手持剪刀,快速剪掉头颈部,倒立动物让血液滴入容器。需注意防止断毛落入容器中。

2、家兔采血方法:

① 耳缘静脉采血:本法为最常用的取血方法之一,可多次反复取血。将家兔固定于兔箱中,拔掉拟采血耳缘部细毛,用手指轻轻弹耳或电灯照射兔耳,使耳部血管扩张,然后消毒。左手压迫耳根,用针头刺破静脉或以刀片在血管上切一小口,让血液自然流出。也可直接用注射器进针耳缘静脉抽取血液。采血完毕用干棉球压迫止血,如一时不易止血,可用木夹夹住耳壳10~20 分钟。

② 心脏穿刺采血:将家兔仰卧位固定在兔台上或由助手捉持,在左胸第2~4 肋部剪毛,常规消毒。于第3~4 肋胸骨左缘心跳最明显处穿刺,针头刺入心脏后即见血液涌入注射器。采血完毕迅速将针头拔出,这样心肌上的穿刺孔较易闭合,针眼处用酒精棉球压迫止血。体重2 公斤的家兔每隔2~3 周可重复采血10~20ml。

③股动脉采血:将家兔仰卧固定在兔台上,左手拉直动物后肢,右手持注射器,以血管博动为指标,将针头刺入股动脉。若已刺入动脉,即有鲜红色血液流入注射器。抽血完毕迅速拔出针头,用干棉球压迫止血。

3、狗的采血方法:

① 后肢外侧小隐静脉和前肢皮下头静脉采血:本法最常用,且方便。后肢外侧小隐静脉位于后肢胫部下1/3 的外侧浅表的皮下,由前侧走向后上侧,前肢皮下头静脉位于前肢脚爪上方背侧的正前方。抽血前,将狗固定在狗台上或使狗侧卧,由助手固定好。剪去抽血部位的毛,常规消毒。一人用力压迫静脉近心端或用止血带绑紧,使静脉充盈,另一人持注射器进行静脉穿刺。取得所需血量后拔出针头,以干棉球压迫止血。

②耳缘静脉采血:当需少量血液或作血常规检查时,可用狗的耳缘静脉采血法。剪毛后先将狗的耳壳加热,或用二甲苯棉球擦耳壳,然后以刀片切割已扩张的血管,使血液滴入容器。

采血完毕,以干棉球压迫切割口以止血。

4、采集血液的注意点:

① 实验动物一次采血量过多或采血过于频繁,都可影响动物健康,造成贫血甚至死亡,其最大安全采血量见表1。

② 采血方法的选择,主要取决于实验的目的和所需血量的多少,所需血量较少时可刺破组织取毛细血管的血,当需血量较多时可作静脉采血,若需反复多次静脉采血时,应自远心端开始。

③ 若需抗凝全血,在注射器或试管内需预先加入抗凝剂,常用的抗凝剂有:

A、草酸钾:常用于供检验用血液样品的抗凝。在试管内加饱和草酸钾溶液2 滴,均匀浸湿管壁后,放入烘箱(80℃)烤干,包好备用。每管能使3~5ml 血液不凝固,供钾、钙含量测定的血样不能用草酸钾抗凝。

B、肝素:取1%肝素溶液0.1ml 于试管内,均匀浸湿试管内壁,放入烘箱(80~100℃)中烤干。每管能使5~10ml 血液不凝固。市售的肝素注射液每ml 含肝素12.500 U,相当于肝素钠125mg。

C、枸橼酸钠:3.8%的枸橼酸钠溶液1 份可使9 份血液不凝固,用于红细胞沉降速率测定。

因其抗凝作用较弱而碱性较强,不适用于供化验用的血液样品。

(二)血清与细胞分离

1、制备血清将全血置于4℃冰箱中保存3-4h,以1500-2000r/min 离心15min。上清液呈淡黄色即为血清,吸出备用;如上清液呈淡红色(甚至红色),表明有溶血,一般应废弃。

2、细胞分离分离血细胞时,采血所有器皿均先行抗凝剂处理。即先将抗凝剂吸入所有器具中,使在器壁上均匀涂布。采血时使抗凝剂溶于血中,并混匀。2000r/min 离心20nim,吸出上清血浆。血浆与红细胞之间白细胞,需要时,把白细胞转入到另外离心管,不需要则废弃。离心管所留的红细胞,加入等体积的生理盐水,轻轻混匀红细胞,再次离心,弃去上清液。如此洗涤3 次,直至上清液为无色透明为此,即获得红细胞。白细胞可依相同洗涤处理。

(三)尿液的收集

1、一次尿收集法:在实验研究中,有时为了某种实验目的,要求每间隔一定的时间收集一次尿液,如每4 小时收集一次,以观察药物的排泄情况。此种情况下,常用以下方法收集尿液。

①逼尿法:本法适用于兔、猫。助手把动物抱住,操作者右手由腹腔向下逐渐用力压迫膀胱,逼出尿液。

②导尿法:本法适用于兔、猫、猴和狗等动物,是较常用的方法之一。动物取仰卧位固定于手术台上,尿道口常规消毒。以左手充分暴露尿道口且固定之,右手持导尿管(尖端涂有消毒凡士林或液体石蜡)顺尿道轻而慢地插入,家兔插入约8~12cm,一旦进入膀胱腔,即见尿液流出。若无尿流出,可将导尿管适当上下左右移动,到尿液流出为止,然后用胶布将导尿管与动物体固定。

③输尿管插管法:本法适用于兔、猫、猴和狗。以兔为例:将兔麻醉后仰卧位固定在手术台上,于耻骨联合上缘沿正中腹白线作一4~6cm 的切口,打开腹腔,在膀胱底两侧找出左右两根输尿管,分离后于两根输尿管下各穿两根线,一根结扎近膀胱端,在结扎线上方向肾脏方

2、连续收集尿液的方法

大鼠和小鼠的留尿法:在小动物的毒理实验中,常常收集24 小时或某特定时间内的尿液。

为此常用代谢笼配上粪尿分离漏斗收集尿液,此装置除支架外均用玻璃或有机玻璃制成,便于清洗。该装置主要包括圆形有机玻璃笼罩,带孔的圆玻璃底盘,供饮水和食料的装置,锥形集尿漏斗和粪尿分离器等。动物置于代谢笼内,粪尿分离漏斗的侧口接一只150~200ml的集尿容器收集尿液。

一般5~6 小时内,平均每只小鼠可收集到0.4~0.5ml 的尿液。如留尿前给予灌胃,每克体重灌液0.02ml,则可增至0.7~0.8ml。未经水负荷的正常大鼠,排尿量约为0.5ml/100g 体重/小时。

猫和兔连续集尿装置的组成部分与大鼠的基本相同。但代谢笼常用铁丝和搪瓷制成。集尿的容器要大一些。

3、收集尿液的注意点

① 尿液收集器必须保证粪尿分开,防止粪便污染尿液。标本容器务须洁净,其容量视动物而定。

② 标本收集后,须在新鲜时进行检验,若需放置时间较久,则须贮放在冰箱或加入适当的防腐剂。

③ 分析尿中金属离子时,代谢笼等应避免用金属材料制成,集尿容器最好用聚乙烯材料的。

④为了满足实验所需尿量,在收集尿液前,可灌喂适量的水及青菜。

(四)实验动物组织匀浆的制备

动物处死后,立即取出所需组织,置于干冰内备用。或置于冰块上,轻轻除去表面的凝血及结蒂组织等附属物,再经冰冷生理盐水洗涤几次,用滤纸吸干水份,称取一定重量的组织备用。如有特殊需要或短期保存,应放入液氮中或冰箱冻结。

将已剥离处理好的脏器定量置于匀浆器中,按设计要求加入一定比例的溶液。以肝组织匀浆为例,称取1 克重的肝组织,在表面皿内剪碎后,以1 : 9(1 份肝组织加9 份0.155M KCl溶液)在匀浆器中稀释,用电动搅拌器以3,000 转/分的转速研磨2~3 分钟。再经3,000 转/分的转速,在4℃中离心10~15 分钟。取上清液即可测定肝组织匀浆的酶活力(GPT 或GOT)。

当制备组织药物萃取的组织匀浆时,基本方法同上,但匀浆的操作不一定在冷冻条件下进行。组织块与适宜比例的无离子水研磨成匀浆后,匀浆不必离心。但有时需水解,使结合的药物变成游离状态,再加入萃取用的有机溶剂,振荡、抽提,使药物或代谢产物萃取入有机溶剂内,从而达到与组织分离的目的。

来源:丁香实验

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