DEAE离子交换吸附试验

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(一)　原理

DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为PH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析 的一种。

(二)试剂和器材

1、试剂:

(1)盐析提取的人γ球蛋白;

(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10%NaN3;

(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG);

(4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分);

2、器材:

(1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目);

(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度计 ，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计;

(3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸;

(4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。

(三) 操作步骤

1、DEAE-Sephadex A-50预处理

称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性;再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中过夜。

2、装柱

(1)将层析柱 垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

(2)将0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋夹，控制流速1ml/分钟，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

(3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

3、平衡:启开出水口螺旋夹，控制流速12-14滴/分钟，使约2倍床体积的洗脱液流出。并以PH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH值与离子强度是否相同。达到一致时关闭出水口，停止平衡。

4、加样及洗脱:

启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应〈床体积的2%，蛋白浓度以〈100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次;再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数ml洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/分钟。

5.　收集：开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

6.　测蛋白：以751-G型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm，与OD260nm，按前述公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。

7.　合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG(MW6000)洗缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐剂，于4℃保存备用。

8.　A-50凝胶的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的杂蛋白至流出液的OD280nm〈0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存;近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

(四)　注意事项

1.　柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就得获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使液体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

2.　纯化过程必须严格控制脱缓冲液的PH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。

3.　所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

4.　洗脱过程中应严格控制流速，且勿过快。

5.　上样的体积要小，浓度不宜过高。

6.　加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。