材料与仪器
肌肉肌球蛋白
焦磷酸钠 柱平衡缓冲液 柱缓冲液 高盐缓冲液 肌球蛋白-DEAE 透析缓冲液
SDS-PAGE
焦磷酸钠 柱平衡缓冲液 柱缓冲液 高盐缓冲液 肌球蛋白-DEAE 透析缓冲液
SDS-PAGE
步骤
一、准备 DEAE 柱和材料
1. 准备贮存液和材料
200 mmol/L 焦磷酸钠（NaPPi )，pH 7.0
用 HCl 和 H3PO4 调 NaPPi 溶液的 pH 值
2x 柱平衡缓冲液：
40 mmol/L NaPPi，pH 7.0
2 mmoI/L DTT
6 mmol/L NaN3
2. 把 DE-52 悬浮在 15 倍体积的 0.5 mol/L HCl 中，搅拌 30 分钟。
3. 用 dH2O 洗 DEAE 直至 pH 超过 4.0。
4. 在 15 倍体积的 0.5 mol/L NaOH 中悬浮 DEAE，搅拌 30 分钟。
5. 用 dH2O 洗 DEAE 直至 pH 为 8.0。
6. 重复酸和 dH2O 这两步（步骤 2 和 3 )。
7. 用浓缩的（2 x ) 柱缓冲液滴定到合适的 pH 值。
8. 用 1x 柱缓冲液平衡 DEAE。
1x 柱缓冲液：
20 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
10 倍体积的缓冲液换 3 次可能比较合适，但是平衡与否应该通过比较起始平衡缓冲液和从沉降了的柱床上取的上清的电导率和 OD280 值来检验。
9. 用平衡了的 DEAE 准备一个 2.5 cm x 60 cm 的柱子（用合适的管路）。
10. 用合适的管路做一个 1 L 的梯度生成器（每个杯子 1 L）。
(1) 加大约 1.05 L 1X 柱缓冲液到梯度生成器的杯子中。
(2) 通过瞬时打开阀门然后关上来赶走阀门和管路中的空气。
(3) 在另一个杯子中加 1 L 高盐缓冲液。
高盐缓冲液：
20 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
其中含 0.5 mol/L NaCl
(4) 去掉多余的缓冲液使梯度生成器两边的溶液高度相等。
(5) 在产生梯度前打开杯子间的阀门。
(6) 从梯度生成器的低盐和高盐杯子中保留小部分样品。使用这部分样品来校正电导率测量值，这样就可以通过组分的号码或体积来知道梯度的盐浓度。
二、用柱层析来纯化肌球蛋白
1. 取 60 mg 用前面的方法获得的肌肉肌球蛋白在肌球蛋白-DEAE 透析缓冲液中透析。
肌球蛋白-DEAE 透析缓冲液：
40 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
2. 在以上述方法准备的 2.5 cm x 50 cm DEAE 柱上加 60 mg 肌球蛋白（5 mg/ml）。
3. 流速调整为 0.5 ml/分钟并立即开始收集组分（穿过峰 )。
4. 用 1x 柱平衡缓冲液洗柱子直到洗脱液的 OD 值和平衡缓冲液的相同（3~5 个柱体积）。
5. 用平衡缓冲液以 0~0.5 moI/L NaCI 线性梯度洗脱肌球蛋白（2 L 总体积，如上面步骤 10 所述配制），收集 10~20 ml 组分。
6. 用 2~3 倍体积的高盐（柱平衡缓冲液中含 1 mol/L KCl）洗柱子来洗脱所有残余的结合蛋白。
7. 检测组分的电导率，蛋白浓度，并通过 SDS-PAGE 检测多肽组成。
1. 准备贮存液和材料
200 mmol/L 焦磷酸钠（NaPPi )，pH 7.0
用 HCl 和 H3PO4 调 NaPPi 溶液的 pH 值
2x 柱平衡缓冲液：
40 mmol/L NaPPi，pH 7.0
2 mmoI/L DTT
6 mmol/L NaN3
2. 把 DE-52 悬浮在 15 倍体积的 0.5 mol/L HCl 中，搅拌 30 分钟。
3. 用 dH2O 洗 DEAE 直至 pH 超过 4.0。
4. 在 15 倍体积的 0.5 mol/L NaOH 中悬浮 DEAE，搅拌 30 分钟。
5. 用 dH2O 洗 DEAE 直至 pH 为 8.0。
6. 重复酸和 dH2O 这两步（步骤 2 和 3 )。
7. 用浓缩的（2 x ) 柱缓冲液滴定到合适的 pH 值。
8. 用 1x 柱缓冲液平衡 DEAE。
1x 柱缓冲液：
20 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
10 倍体积的缓冲液换 3 次可能比较合适，但是平衡与否应该通过比较起始平衡缓冲液和从沉降了的柱床上取的上清的电导率和 OD280 值来检验。
9. 用平衡了的 DEAE 准备一个 2.5 cm x 60 cm 的柱子（用合适的管路）。
10. 用合适的管路做一个 1 L 的梯度生成器（每个杯子 1 L）。
(1) 加大约 1.05 L 1X 柱缓冲液到梯度生成器的杯子中。
(2) 通过瞬时打开阀门然后关上来赶走阀门和管路中的空气。
(3) 在另一个杯子中加 1 L 高盐缓冲液。
高盐缓冲液：
20 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
其中含 0.5 mol/L NaCl
(4) 去掉多余的缓冲液使梯度生成器两边的溶液高度相等。
(5) 在产生梯度前打开杯子间的阀门。
(6) 从梯度生成器的低盐和高盐杯子中保留小部分样品。使用这部分样品来校正电导率测量值，这样就可以通过组分的号码或体积来知道梯度的盐浓度。
二、用柱层析来纯化肌球蛋白
1. 取 60 mg 用前面的方法获得的肌肉肌球蛋白在肌球蛋白-DEAE 透析缓冲液中透析。
肌球蛋白-DEAE 透析缓冲液：
40 mmol/L NaPPi，pH 7.0
1 mmol/L DTT
3 mmol/L NaN3
2. 在以上述方法准备的 2.5 cm x 50 cm DEAE 柱上加 60 mg 肌球蛋白（5 mg/ml）。
3. 流速调整为 0.5 ml/分钟并立即开始收集组分（穿过峰 )。
4. 用 1x 柱平衡缓冲液洗柱子直到洗脱液的 OD 值和平衡缓冲液的相同（3~5 个柱体积）。
5. 用平衡缓冲液以 0~0.5 moI/L NaCI 线性梯度洗脱肌球蛋白（2 L 总体积，如上面步骤 10 所述配制），收集 10~20 ml 组分。
6. 用 2~3 倍体积的高盐（柱平衡缓冲液中含 1 mol/L KCl）洗柱子来洗脱所有残余的结合蛋白。
7. 检测组分的电导率，蛋白浓度，并通过 SDS-PAGE 检测多肽组成。
来源：丁香实验
