高效液相色谱、液液色谱、液—固色谱法的固定相和流动相

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液相色谱和气相色谱技术

高效液相色谱的固定相和流动相

一、固定相

高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

1. 表面多孔型固定相

它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子 筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高;颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。

2. 全多孔型固定相

由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗 粒很细(5～10µm)，孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。

二、流动相

由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：

(1)溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。

(2)溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不

透明的，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。

(3)高纯度

由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也

要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。

(4)化学稳定性好

(5)低粘度(粘度适中)若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等;但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

液—固色谱法

液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值;当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段;不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性(即对分子量的选择性小)，不能用该法分离分子量不同的化合物。

一、液固色谱法固定相

液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。

三、液-固吸附色谱流动相

液相色谱的流动相必须符合下列要求：

(1)能溶解样品，但不能与样品发生反应。

(2)与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。

(3)粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。

(4)应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶

剂要不吸收紫外光。

(5)容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广则使用梯度洗脱。

液液色谱法

液液色谱又称液液分配色谱。在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数(K)或分配比(k)小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱 法不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。

一、固定相

液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：

(1)表面多孔型载体(薄壳型微珠载体)，由直径为30 ~ 40µm的实心玻璃球和厚度约为1 ～ 2 µm的多孔性外层所组成。

(2)全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30 ~ 50 µm的多孔型颗粒。

(3)全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为5 ～ 10 µm。由于颗粒小， 所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。

由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如， —氧二丙腈(ODPN)，聚乙二醇(PEG)，十八烷(ODS)和角鲨烷固定液等。

二、流动相

在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两 个极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。

以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为正相分配色谱，适合于分离极性化合物;反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。