细菌细胞壁糖的薄层层析

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薄层层析（TLC）技术

 

一、实验目的

1.熟悉薄层层析 的操作步骤。

2.掌握薄层层析法分析细菌 细胞壁糖的原理和方法。

二、实验原理

簿层层析是一种微量而快速的层析方法。该方法是把吸附剂或支持剂(例如硅胶或硅藻土)涂在玻璃板上成为一簿层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品中各个成分分离，最后进行定性鉴定和定量测定。因为层析是在吸附剂的薄层上进行的，所以称为薄层层析。实际上，薄层层析和柱层析 、纸层析在原理上和操作上都是很相似的。柱层析是把吸附剂装在管中形成一个柱，在柱上进行分离。纸层析是用纸作为支持剂进行层析。薄层层析则是用铺于玻璃板上的吸附剂薄层进行层析。但是薄层层析兼备了柱层析和纸层析两者的优点。因为薄层层析是在敞开的薄层上操作的，所以它和纸层析一样，在确定混合的组分是否分开和显色等方面都比较方便，只要把显色剂直接喷到薄层上即可观察.而柱层析则要把层析谱从柱中推出或进行洗脱，然后分段收集洗脱液才能设法鉴定。在显色方面，纸层析不能用腐蚀性的显色剂，而薄层层析(如果用硅胶、氧化铝、硅藻土等无机物铺成薄层)却能耐受浓硫酸等试剂的作用。柱层析所需的样品量较大，不适于小量样品的分离;纸层析只适用于小量样品的分离;薄层层析则适应样品量范围大，一般为1μg～500mg，灵敏度高。薄层层析的另一突出的优点是展开的时间特别短(一般为几到几十分钟)，这样迅速而有效的分离效果是柱层析和纸层析所不可比拟的。由于薄层层析具有以上这些优点，而且操作方便，设备简单，所以薄层层析方法发展很快，应用范围广泛。

目前已知，细胞壁组成成分中氨基酸组分占有很高比例，与这些氨基酸相联系的变化组分是糖和氨基糖。通常，每个细菌的属具有一个特征性的细胞壁组成成分，在一个属中糖在相对比例上的变化，可以区分不同的种。因此细胞壁的组分之一糖的分析鉴定，在细菌分类中有着重要的意义。糖的分析已列为细菌分类的生化指标之一。特别是对棒状菌和放线菌来说，细胞壁中的糖是重要的分类指标。本实验采用了具有吸附层析原理的硅胶薄层层析.来分离鉴定细菌细胞壁中所含的糖类物质，为细菌的分类检索提供生化组成方面的依据。

三、仪器、原料和试剂

仪器

摇床、超声波发生器，功率150w、离心机、安管、5cm×15cm 玻璃板、吹风机、烘箱、酒精水平仪、喷雾器。

原料

枯草芽孢杆菌。

试剂

1. 菌体培养基

2. 0.05mol/LpH7.6磷酸盐缓冲液

3. 胰蛋白酶

4. 氢氧化钠

5. 羧甲基纤维素

6. 0.8%生理盐水

7. 2mol/L 的盐酸

8. RNA 酶

9. 硅胶H

10. 乙酸乙酯

11. 甲醇

12. 乙酸

13. 已知糖溶液：称取标准糖鼠李糖、甘露糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖各50mg，分别溶于5mL 水。

已知糖混合液：将上述糖溶液以等体积混合。

14. 苯胺—二苯胺—磷酸试剂：4g 二苯胺，4mL 苯胺及20mL85%磷酸溶于200mL 丙酮。苯胺存放时间过久，颜色变成棕黄色，需重配后使用。

15. 茴香醛—硫酸试剂：取0.5mL 茴香醛加到50mL 乙酸中，混匀，再加入1mL 浓硫酸。临用前配制。

16. 1，3—二羟基萘酚—硫酸试剂：20mg1，3—二羟基萘酚加10mL 乙醇，再加0.2mL 浓硫酸。