免疫组织化学技术的发展概况

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（一） 免疫 荧光细胞化学技术
1941年，浣熊等建立了免疫荧光细胞化学技术，它的原理是根据抗原 抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。目前，免疫荧光细胞化学技术已经广泛地应用于许多研究领域，如免疫学、微生物学、病理学和临床检验学等。
由于免疫荧光细胞化学技术所具有的特异性、快速性和某方面的准确性，又由于许多新技术和仪器的应用如激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜、荧光激活细胞分类器等，该项技术可发展至更高的阶段，开创更新的领域。虽然如此，应用于临床作为病理学的诊断还是少之又少，相信随着各种技术的提高，在不久的将来，将会有更多的荧光抗体被应用于临床的诊断。

（1）常用的抗体和蛋白质标记的荧光素有：
①异硫氰酸荧光黄（Fluoresein isothiocyanate，FITC）：结晶粉末状，呈黄色、橙黄色或褐黄色，易溶于水和酒精等溶剂，室温下可保存两年以上，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
②四甲基异硫氰酸罗达明（Tetramethylyodamine isothiocyanate，TRITC）：结晶粉末状，呈紫红色，易溶于水和酒精等溶剂。最大发射光谱为620nm，呈现橙红色荧光。
③四乙基罗达明（Tetramethylyodamine B200，RB200）：结晶粉末状，呈褐红色，易溶于酒精和丙酮，但不溶于水。最大发射光谱为596～600nm，呈现橙红色荧光。

（2）常用的荧光标记法
①直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，于荧光显微镜 下观察检查，作出判断。
评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其存在不足就是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。
②间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。
评价：本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。
1.存在问题：
2.制作好的切片不能长期保存，影响各种资料的积累。
3.所作出的结论较主观。
有些经固定的石蜡切片不适合等。

（二）免疫酶细胞化学技术
这种技术的基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时，抗原抗体复合物中带有标记结合上去的酶，其特性可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产生不溶性的有色产物，从而可用一般光镜来检测判断，确定组织的来源、种属和部位。
评价：
1.优点：
2.可用光镜检查。
3.切片可长期保存，有利于资料积累。
4.可以会诊，所得结果较为客观。
5.既适用于冰冻切片，也适用于石蜡切片。
技术较为简单，易于普及和推广。
1.存在问题：
2.酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学。
3.酶标记抗体分子量较大，对组织的穿透性较缓慢。
4. 抗血清中的非特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合，常可引起背景的染色，影响阳性物的判断。
敏感性不强，目前已不被使用。