酶联免疫法测ABA含量
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实验原理 本方法是一种固相抗原 型酶联免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线,对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。
测定方法
1.包被:在微量滴定板内准确加入100μLABA包被液,37℃湿盒过夜。
2.标样稀释?:取8支试管每管加150μLDB,第一管中加入50μL(2000ng/50μL)标准液,充分涡旋后,取50μL至第二号管中,同样涡旋后,取50μL到第三管;依次稀释到第六管,稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。
3. 洗板:从37℃湿盒中取出滴定板,恢复到室温后,弃去包被液,用WB(洗涤缓冲液)洗涤三次,甩干(吸水纸)。
4.加样:1~8孔对应加入ABA标样50μL,10号孔相应加入最浓ABA标样,9号孔加50μLDB,三排重复;然后每孔加50μL抗体,37℃ 45分钟。
5.洗板:
6.加酶标二抗:每孔加100μL,37℃反应1小时。
7.洗板:
8.显色:各孔加10μLOPD显色液,37℃ 20分钟。
9.终止反应:各孔加50μL 6NH2SO4。
10.读数:490nm读取OD值。其中10号孔调零,而9号孔为最大值(B0),1~8号孔的OD值为B。
11.结果计算:以In(B/B0)∕(1-B/B0)为纵坐标,以标准ABA浓度的常用对数(lg[ABA])为横坐标,绘制曲线。