酶联免疫法测ABA含量

仪器 ：
酶联免疫仪
酶标板
752分光光度计

实验原理 本方法是一种固相抗原型酶联免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线,对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。

测定方法
1.包被：在微量滴定板内准确加入100μLABA包被液，37℃湿盒过夜。
2.标样稀释?：取8支 试管 每管加150μLDB，第一管中加入50μL（2000ng/50μL）标准液，充分涡旋后，取50μL至第二号管中，同样涡旋后，取50μL到第三管；依次稀释到第六管，稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。
3. 洗板：从37℃湿盒中取出滴定板，恢复到室温后，弃去包被液，用WB（洗涤缓冲液）洗涤三次，甩干（吸水纸）。
4.加样：1～8孔对应加入ABA标样50μL，10号孔相应加入最浓ABA标样，9号孔加50μLDB，三排重复；然后每孔加50μL 抗体 ，37℃ 45分钟。
5.洗板：
6.加酶标二抗：每孔加100μL，37℃反应1小时。
7.洗板：
8.显色：各孔加10μLOPD显色液，37℃ 20分钟。
9.终止反应：各孔加50μL 6NH ₂ SO ₄ 。
10.读数：490nm读取OD值。其中10号孔调零,而9号孔为最大值(B ₀ ),1~8号孔的OD值为B。
11.结果计算：以In（B/B ₀ ）∕（1－B/B ₀ ）为纵坐标，以标准ABA浓度的常用对数（lg ^［ABA］ ）为横坐标,绘制曲线。