免疫酶细胞化学—固定和切片

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一、固定

若想得到理想的ICC染色结果、正确地判断抗原 物质在组织细胞内的位置，除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性(Immobility)和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是ICC染色中非常重要的一环。

ICC与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织抗原的免疫 活性。一般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。Cumming(1980)报告，不固定的组织切片ICC染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的关键一步。

用于ICC的固定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法见第一章　，下面介绍两种近年报道的新方法。

1.AMEX(Acetone Meth Enzoate Xylene )法　 　是改良的冰冻置换法(freeze substitution)的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)报告，该法具有同新鲜(未固定)组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机制为：组织在丙酮中固定(脱水)，组织细胞内水份逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20℃丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮过夜。实际上组织在4℃丙酮内过夜亦可得到同样效果。如在该固定液内加入少量蛋白酶活性 阻断剂，并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。

2.微波固定(Microwave fixation)　 　为近几年所注目的问题之一。该方法能保持良好的组织结构和抗原性，适于各种切片的酶组化、ICC以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与微波(频率1000～3000MHz)具有被水分吸收的性质(通常所用的微波是频率2450MHz，波长12cm);生物材料含有大量水份，照射后，温度升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内达到固定的效果等有关。经微波照射固定的组织，需置相同固定液中，继续固定2～6h，室温。

近年研究的专门固定用的微波炉已商品化，例如：Bio-Rad H2500型、日新EM·MWE-2等，该类微波炉能够准确地调节　照射时间和测定被照材料的瞬时温度。利用家庭微波炉代替时，应选用能以秒为单位调控的微波炉。实验材料不同，所需固定液的量、照射时间等各异，所以应在预实验的基础上，找出合适的固定液量、照射时间和温度。

多数实验室的条件为：固定液5～10ml，照射10～30s，照射后固定液的温度≤50。C。其方法为：将实验标本置于微波炉旋转台的中央，周边放一烧杯盛300～500ml纯水，吸收照射时炉内产生的热量，选择强挡照射10～30s 。接通电源(on)至微波产生利用超声波代替微波照射，或二者并用，照射后，组织标本和固定液的温度升高较少，亦能获得短时间内良好的固定效果(Yasuda 1992)。

二、切片

光镜ICC染色，常用的有冰冻切片和石蜡切片两种，二者各有其优缺点，应根据抗原的性质、实验室条件，合理选择之。对未知抗原显示时，最好同时应用。冰冻切片为ICC研究所首选。

Shi(1991)等报告：微波炉照射的切片，能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高热的作用，使核内DNA双链解开，DNA、RNA解离，抗原暴露有关。其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，反复多次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，补充瓶中蒸发掉的液体，照射温度不超过90～95℃为宜。此处理后，细胞核染色以苏木精为佳。