免疫酶细胞化学—染色方法

互联网2013-09-06

2933

相关专题

一、酶标抗体法

酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。

(一)酶的种类及特点

从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。

表4-1 免疫细胞化学常用的酶

名称	分子量	内源性	商品
Horseeradish peroxidase(E.C.1,11,1,7)	40～45KD	+	有
Alkaline phosphatase (E.C.3,1,3,1)	80～120Kd	++	有
Acid phosphatase (E.C.3,1,3,2)	100Kd	+++	有
Glucose oxidase	160～190kD	－	有

Sternberger(1986)指出，用于标记的酶应具备以下几点①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察;②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位;③较易获得的酶分子，最好有商品出售;④中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变，且酶的催化活性(Turnover)越高越好;⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性;⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。

其中，①②两点甚为重要，因为并非容易显示的酶均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP)较佳，是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根(西洋山嵛菜)的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占16%～18(8条糖链分布在HRP分子表面)，分子量40kD，最适pH5～5.5，最适温度40～45℃; pH4～11，50℃以下均较稳定，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含铁卟啉，称辅基，最大吸收光谱为403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光谱为275nm，HRP的纯度是用二者的光密度比值(Od 403/275)衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般认为，标记酶的RZ值为3.0左右，不应小于2.8，RZ值越小，酶的纯度越差，例如RZ值为0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高达75%。对于纯度低、质量差的酶，需纯化后使用。

除HRP外，碱性磷酸酶(Alkaline phasphotase, ALP)和葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)也较常用。ALP分子量约为HRP的2～3倍，最适pH9.0～9.5左右，比较稳定，内源性ALP也较易消除，大部分均可被左旋咪唑(Levamisole,分子量240.8kD)抑制，但肠粘膜表面的内源性ALP活性不受影响。目前所用的ALP大多系由牛的肠粘膜提取制得，所以肠粘膜等呈强阳性反应。

ALP最初是由Bulman等用于标记抗体的。选用不同的底物，可形成不同颜色的终产物，例如以萘酚(As-Mx)和快蓝(Fast Blue, FB)为底物，生成蓝色沉淀。用快红(Fast Red, FR)代替FB，形成红色不溶沉淀。与HRP/4-氯-1-萘酚(CN)或DAB形成的沉淀形成鲜明对比，但FB、FR等沉淀物溶于有机溶剂，不能进行脱水、透明等处理。据报告，利用新品红(New fuch-sine )显色，形成的红色沉淀产物不溶于有机溶剂，不褪色，轻度核复染后，可制成半永久性保存标本。

GOD所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基四唑蓝(P-Nitroblue Tetrazolium),终产物为不溶性的蓝色沉淀，比较稳定。从理论上讲GOD较ALP、HRP为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性GOD，但其分子量较大，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶的活性，故GOD主要用于ICC双重染色和两种酶的放大技术。

(二)酶标抗体的制备(Boosma,DM, 1983)

酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥-偶联剂的作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，具备3个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结;②偶联剂不应影响酶和抗体的活性;③不能因偶联剂的加入，使酶与组织成分了生非特异结合。

在HRP标记抗体中，常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠及Maleimide等，现简介如下。

1.戊二醛标记法 　　戊二醛为制备各种酶标抗体最常用的偶联剂。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯释及戊二醛自身聚合本等杂质，故需纯化后使用。戊二醛的纯度用含杂质的二醛的单体戊二醛的OD比值表示，它们的最大吸收光波长分别为235nm 和280nm，二者的OD比值(235/280)小于3时，制备酶标抗体的效果较好，大于3时，需经蒸馏或Sephadex G-10柱层析或活性碳吸附等处理，除去杂质后应用。其制备方法分一步法和两步法;基本原理相同，是使戊二醛的两个醛基之一与酶蛋白的赖氨酸结合，另一醛基与免疫球蛋白上的氨基结合，将酶连结于抗体上。

(1)一步法：将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。优点是简单省时，缺点是反应程度不易被控制，因为酶蛋白分子和抗体蛋白分子同戊二醛间的反应速率不同，抗体蛋白的氨基数远较HRP为多，与戊二醛反应快，因此在戊二醛的作用下，抗体蛋白易通过分子内和分子间的彼此交联，形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记。据Nakane等推算，加入的HRP仅20%与抗体连结，标记率较低(约1%～5%)很难获得理想的酶标抗体。

(2)二步法：首先用过量的戊二醛与HRP反应(HRP：戊二醛为1：105)，以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离;然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP(HRP-戊二醛复合物)，再加入过量的抗体，使活化HRP上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过量的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的HRP与抗体(IgG)比例不同，酶标记率各异，平均为5%～25%。标记步骤如下：

①10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中(0.1mol/L磷酸缓冲液配制)，18h室温。

②透析或 Sephadex G-25柱层析(0.15mol/l NaCl平衡)，去除过量的戊二醛，收集活化HRP。

③浓缩活化HRP至10mg/ml左右，加入抗体5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

④碳酸盐缓冲液(pH9.5)调整pH至9.0～9.5,使抗体与活化HRP结合，4℃24h。

⑤加入0.1ml赖氨酸缓冲液，阻断未反应的醛基，4℃，2h。

⑥用半饱和硫酸铵沉淀5次，对PBS透析24h，4℃，换3次PBS，除去硫酸铵(10000rpm/min,30min)。

⑦或用凝胶色谱法(Sephadex G-200/Sephacryl S-200) 等分离标记抗体。

注意：该方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体;而RZ值小于2.8的HRP，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。

2.过碘酸盐氧化法　　严格地讲，过碘酸钠(Sudium periodate)不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助于过碘酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适于含糖较丰富的酶(如HRP)的标记。我们知道，HRP分子的糖本身与酶活性无关，利用过碘酸钠氧化这部分糖分子内的-CH基，使之生成-CHO基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成Shiff’s碱。此Shiff’碱在pH降低时呈可逆性解离，所以经氢硼化钠(NaBH4)还原，形成稳定的酶标抗体复合物(图4-1)。为防止生成的-CHO基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯(Dintro-fluorobenzene)处理HRP，阻断分子内的ε-、α-氨基。

图4-1　过碘酸盐氧化原理

过碘酸盐氧化法，酶的RZ值≥3时较佳;RZ<3时，糖含量较少，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量，据报告，适当地控制过碘酸盐溶液及反应条件，几乎所加入的HRP和抗体均形成酶标抗体，其标记率为70%左右。具体步骤为：

(1)4mg HRP(RZ=3.0)溶于1.0ml双蒸水中。

(2)加0.2ml新鲜配制的0.1mol/LNaIO4，轻轻摇动混合20min,肉眼可见液体内棕黄变成深绿色。

(3)对0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.4)透析，20h，4℃。

(4)调整HRP液体的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5),立即加入抗体(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸盐缓冲液溶解),轻轻混匀后,置室温2h。PH≤8.5时,抗体的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能与CHO基反应,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。

(5)加入0.1ml新鲜配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以稳定酶标抗体复合物。

(6)经透析等去除未反应的NaBH4 ，避免还原过度。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体(方法同戊二醛法)。

如此制得的酶标抗体，加入终浓度1%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)分装后于-80℃可保存数年;亦可加入6%等量甘油，混匀置-20℃/4℃保存1年左右。上述两种标记法是ICC研究中最常用的酶标抗体制备方法。

3.Maleinmide法　　上述酶标抗体(IgG)的分子量较大，对抗体的穿透性有一定影响，而在制备过程中，需经两次纯化，即多聚体与单体及单体与非标记抗体的分离。已知单体(1个HRP分子标记1个IgG分子)的分子量为190～200kD，非标记抗体为146～150kD，用凝胶过滤法很难将二者分开。所以,Sternberger等进行了抗体片段Fab的标记。用植物性蛋白酶---木瓜酶(Papain)水解抗体蛋白，可获得一个无抗体活性稳定的Fc段结晶和两个相同的抗原结合片段(Fab)，此Fab段为单价，分子量50kD,HRP标记后，单体分子量为90kD,较容易将单体和非标记的Fab段分离。在此基础上，Imagawa(1982)又进行了改良，引入了N-羟基丁二酰酯(Maleinmide)，标记抗体的特定部位---Maleinmide法。该方法的主要原理是：(1)借助双功能试剂Maleinmide活化HRP，使其具有与—Hs 基反应的能力;(2)利用胃蛋白酶水解IgG，IgG重链在近羧基端被切断，这样在绞链区(Hinge region)至少可以保留一个S-S键，从而得到一个具有双价抗体活性的F(ab')2段。该S-S键与抗体活性无关。可以通过加入硫基乙醇(2(β)-Mercapto ethanol, HSCH2CH2OH)使其断裂，被还原成—HS基。如此双价抗体活性的F(ab')2片段即变为带有—Hs 基的单价Fab’片段，后者再与活化的HRP结合，便制成了酶标抗体Fab'。由于空间遮蔽的关系，绞链区即使存在两个—HS基，也只能有一个能与酶结合，另一个—HS基不能与酶反应，即酶与抗体Fab’段结合比例为1：1，因此酶标抗体Fab’段绝大多数是单体，很少形成多聚体。在标记过程中，应用过量的活化HRP，还能避免非标记抗体Fab'段的存在。Fab'段的分子量与Fab段相似(50kD左右)，所以酶标后Fab'亦较容易与未标记的Fab'分离。此标记方法多用于酶免疫分析研究，其步骤为：

①6mg HRP溶于1.0ml PBS(pH7.0)中。

②4mg Maleinmide 溶于0.5ml N, N二甲基酰胺(N,N-dimethylformamide)中。

③将上述两种液体充分混合，持续搅拌1h,30℃。

④离心取上清，经0.1mol/l PB(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱层析，收集含有蛋白部分的洗脱液，浓缩，制得活化HRP。

⑤每1.8mg活化HRP，加入已被还原的Fab'2mg,4℃20h持续搅拌。

⑥ Sephadex G-200/Sephacryl S-200分离酶标抗体Fab'片段，保存同前。

(三)酶标抗体的纯化

上述各种方法制备酶标抗体时，除产生酶标抗体外，还有未标记的抗体蛋白、游离酶、酶二聚体及偶联剂等。这些均可使酶标抗体的敏感性下降，故酶标抗体须经纯化后应用。现简介几种常用的纯化方法。

1.多聚体的分离 　　实验中，不同的试剂形成的多聚体的数量各异，即使同样的实验药物和程序，在不同的时间制备的酶标抗体中，多聚体的数量亦不相同。多聚体较单体含酶量多，与组织的非特异吸附增强，使方法的敏感性下降，故用前必须除去多聚体。以凝胶过滤法分离多聚体的效果较好。

2.非标记抗体的分离 　　非标记抗体与标记抗体具有相同的免疫学特征，能竞争与组织特异抗原结合，而且亲和力较标记抗体强，优先与组织抗原结合。一般认为每个抗体连结1～2个酶分子，并不影响抗体的两个(Fab)抗原结合点，但因存在空间遮蔽现象，一个Fab段与组织特异性抗原结合。非标记抗体则不存在这种现象，两个Fab段均与抗原结合，因而亲合力较强。所以酶标抗体在应用前须用琼脂糖亲合层析等方法去除非标记抗体。

3.亲合层析 　利用蛋白A(Protein A)/琼脂糖-刀豆素A/琼脂糖亲合层析柱能制得较纯的酶标抗体。因为蛋白A与抗体(标记和未标记)间有较强的亲合力，不与HRP结合。而刀豆素A与HRP(标记和游离)间的亲合力非常强，不与抗体结合。据此二者并用，能获得较纯的HRP酶标抗体。该方法省时，分离能力强(约为凝胶层析的600倍)。但有一定的局限性，因为蛋白A并非与所有种属的免疫球蛋白亲合力均较强，例：不能与羊的免疫球蛋白结合，所以难以用于纯化羊的酶标抗体。而刀豆素A与HRP的亲合力极强，甚至呈不可逆性结合，可使部分酶标抗体的活性丧失。

(四)染色原理及步骤

1.基本原理 　　酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体(80%～90%的抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆抗体系由小鼠制备);第二抗体则为第一抗体(家兔/小鼠的IgG)的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同一标记的第二抗体就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以间接法为常用，在此着重介绍间接法的染色程序。

2.染色程序

(1)切片准备：见第一章　。

①石蜡切片经二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行酒精至水。②固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上。

(2)未固定的新鲜组织切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，简而言之，即用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成的空间遮蔽(室温)，风干15～30min.;已固定的组织冰冻切片及石蜡切片，根据需要可进行组织抗原的激活。

(3)用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节　省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。石蜡切片(滴少量PBS，以防其干燥)直接进行步骤(6)。

(4)切片经PBS或其它缓冲液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰冻切片上的OCT包埋剂。但应用ALP标记抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使ALP失活。

(5)根据需要，用甲醇+0.3%H2O2处理切片15～30min(室温)，封闭内源性过氧化酶的活性。应用ALP标记抗体时，此步可省略。

(6)PBS漂洗2min(共两次)，移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min(室温)。Tween-20为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的显示。

(7)4%Block Ace或0.1%～1%BSA湿盒内孵育15～25min(室温)，然后;轻轻弃去孵育液(不冲洗);以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。

(8)根据需要，可用1/5～1/30正常来活兔/羊血清孵育15～20min(室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前的血清)。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时，加入1%～2%的同一种属正常血清。

(9)轻轻弃去孵育液，滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀释的第一抗体(抗体用量：每张切片一般为50～80μl)，湿盒内孵育1～2h(20～25℃);免疫电镜用标本，4℃过夜。

(10)PBS充分冲洗(3次×2min)，以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。

(11)经0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀释的HRP酶标记的第二抗体,湿盒内孵育45～60min(20～25℃)。

(12)PBS漂洗(3次×2min),此处不需分别漂洗，因所有切片均系同一酶标抗体孵育。

(13)未固定或固定较弱的冰冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸钙而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min(室温)此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保存第一抗体孵育前的组织抗原，尤其适用于单克隆抗体的ICC染色。

(14)呈色：HRP标记抗体的呈色液为0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片经PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液内10～15min(室温、暗处)，亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察的标本，呈色3～5min即可，防止DAB终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，避免DAB本身氧化变质。新配制的DAB为无色透明液体。若DAB液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。

(15)将切片置流水中(仅光镜观察)或PBS(电镜标本)内，终止呈色反应。

(16)未固定的冰冻切片，可用1%戊二醛-PBS液加强固定5～10min(室温)，流水冲洗。

(17)细胞核轻度染色，以甲基绿和苏木精为常用。前者细胞核呈绿色，与HRP/ALP等终产物对比度尤佳，但不适于微波照射的标本。苏木精是组织学、病理学研究中普遍应用的核染色方法，与HRP、ALP的终产物对比度比较好。

(18)DAB呈色的标本，可以系列酒精脱水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物质呈色的标本，在有机溶剂中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固剂如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周围涂少许女士用指甲油，可使切片保存时间更长。

(19)镜检、观察记录同一般形态学研究。

(20)免疫电镜用标本，经OSO4后固定，按电镜标本要求处理(参见本书第七章　)。亦可OSO4固定，喷碳(Carbon Coating),利用扫描电镜观察抗原的存在部位。

3.酶标抗体及发色剂的选择

HRP特异底物为H2O2,在分解H2O2过程中,与H2O2形成复合物,无电子供体存在时,反应不再进行,当电子供体存在时,迅速生成水,酶被还原,电子供体被氧化环化,形成苯乙胼聚合体(图4-2)。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。

图4-2 DAB反应产物形成过程

HRP催化的酶促反应第一步是特异性的—酶催化底物H2O2，其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体，可使终产物呈不同颜色，例如：CN(4—Chloro—1– N aphthol)为蓝黑色，TMB(Tetramethyl—Benzidine )为深蓝色，AEC(3—amino—9– ethyl--carbazole)为红色。市售试剂盒所配显色液以AEC居多，室温下较稳定，但不能进行脱水等处理，且时间长易褪色。DAB是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明、半永久保存，且终产物具有嗜饿性，经O2O4处理，电子密度增加，适于电镜下确定抗原的存在部位。但是DAB被认为可能具有致癌性，所以应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。

(2)ALP，是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。显色液内加入终浓度为2～4mmol/l 的levamisole, 大多数内源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑(levamisole)以每毫升60～120mmol/L浓度的贮存液-20℃冰箱保存。应用时稀释30倍。为避免反复称取，试剂吸水，As-Mx、FR、FB试剂均应小量分装后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液30ml计算，分装As-Mx 5～7mg/支、Fr 8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀释30倍，过滤显色。FR、FB等在光照射条件下易引起沉淀，故显色反应在暗处进行。

(3)GOD，是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS(Phenazine Methylsulfate)0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但GOD的敏感度较HRP和ALP为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法和敏感性和特异性。即用GOD和HRP分别标记第二、第三抗体(例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为GOD标记的兔抗鼠IgG，第三抗体则为HRP标记的羊抗兔IgG)，ICC染色，以葡萄糖-DAB作显色剂。基本原理如(图4-3)。在这里HRP是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化时生成的H2O2作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且GOD和HRP所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：

①切片经第一抗的孵育;②漂洗，GOD标记的第二抗体孵育40～60min(室温);③漂洗，HRP标记的第三抗体孵育30～45min(室温);④漂洗，显色、脱水透明观察同前。

图4-3　两步酶催化反应原理

二、非标记抗体酶法

由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性;②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法(Enzyme Bridge Method)和过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法)。现分述如下。

(一)酶桥法

1.基本原理　　首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节　省第一抗体的用量。

2.染色步骤主要程序如图4-4

图4-4　酶桥法主要染色步骤

(1)切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体(假设来自种属A)孵育24h(4℃)。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。

(2)切片与第二抗体(也称桥抗体，抗种属a IgG抗体)孵育1～1.5h(室温)。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。

(3)切片与抗酶抗体(来自种属A)孵育1～1.5h(室温)。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。

(4)切片与酶(HRp 70～100μg/ml,PBS溶解)孵育0.5h(室温)，酶与抗酶抗体结合。

(5)显色等与酶标抗体法相同。

酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶(70%左右)丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。

(二)PAP法

1.PAP的制备及特征　PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。

(1)制备抗HRP血清：健康雄性家兔(2.0kg以上)，可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗(共10mg)，2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[(福氏完全佐剂，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];间隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg;再间隔2周，第3次注射，2mgHRP(溶于2ml生理盐水中)，分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射(条件同第3次)，一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法(HRP0.1mg/ml)为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。

(2)制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高(RZ≥3)，而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。

【步骤】

①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP(1.0mg/ml)的水溶液。

②混匀，室温1h后，离心16000g 4℃15min。

③0.9% NaCl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 4℃15min，重复4次。

④加15.3ml HRP水溶液(含HRP30.64mg)，室温，持续搅拌。

⑤用1N HCl及0.1N HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1N 及0.1n NaOH调pH至7.2。

⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃45min。

⑦离心35000g 0℃15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。

⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液(48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L)透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。

【质量鉴定】

制备的PAP复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定PAP复合物的质量。常用分光光度计检测PAP的复合物在280nm(IgG的最大吸收波长)和400nm(HRP的最大吸收波长)的光密度值(OD值)，按下式计算IgG和HRP的含量：

一般HRP/抗HRP的克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的PAP复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的PAP复合物不稳定，4℃可保存2～3周。最好临用前配制。

【PAP复合物的特征】

PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。

2.PAP染色原理及步骤

(1)原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。

(2)染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。

①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法;切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。

②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。

图4-5　PAP法主要染色步骤

③用离体制得的PAP复合物(1：30～300稀释)孵育1～1.5h(室温)，使其被桥抗体连结在第一抗体上。亦可用ALP抗ALP复合物代替。

④显色观察等同间接法。

3.PAP法的评价 　　PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：

(1)抗体活性高：非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程(共价键连结)对抗体活性的损害。

(2)灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度;但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比(Signal/moise,S/N)表示。据此，Sternberger(1979)认为PAP法较间接法敏感20～25倍，可进一步稀释第一抗体，以节　省其用量。但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”(游离)的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。另外，PAP复合物分子量较大(400KD),冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体(分子量90～180kDa)，所以不适于免疫电镜的标本制作。

(3)背景染色低：在酶标抗体法中，被标记的非特异性抗体可与组织成分结合，造成背景染色(图4-6)。从理论上讲，在非标记抗体法，连结抗体中，即使存着非特异性抗体，因其不是抗第一抗体种属IgG的特异性抗体，故亦不能与抗HRP抗体结合，不能把PAP复合物连结在此非特异性抗体上(图4-7)。当然，PAP复合物内也可能存在些非抗HRP的抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，但因其不是抗HRP的抗体，故不能与HRP结合，无酶活性。因此说桥抗体的引入，使ICC的特异性得到了双重放大，S/N增大。但也有人认为，过量的桥抗体及PAP复合物等均易与Fc受体结合，致使背景染色增强。实验表明：合适的切片准备、恰当地应用封闭性阻断剂、正常血清以阻断非特异性结合，加之适当地选择抗体稀释度和抑制内源性酶活性，PAP法和间接法二者的背景均相当低。

图4-6　间接酶标抗体法

图4-7　PAP法降低背景的原理

(4)假阴性及其处理：应用PAP法显示抗原含理较多的组织或冰冻切片组织抗原保持良好的标本时，可导致阴性结果，这种现象称为假阴性。Vandesand发现：应用PAP法显示大鼠视上核和室旁核内加压素神经细胞分布时，第一抗体(1：200)染色，加压素含有细胞呈强性。如果取材前24～48h，脑室内注射秋水仙素，阻断轴突运输以增加视上核和视旁核加压素含量，同时组织标本经脱水、透明、再水化等处理以增加抗体的通透性，同样稀释度染色，结果却阴性。进一步实验发现：增加抗体的稀释度，开始出现阳性染色，稀释至1：1500时，染色最强，继续增加抗体稀释度，染色强度则下降。Bigbee(1977)认为假阴性是第一抗体用量过高与组织抗原结合过多，使相邻两个伉体的Fc段间的距离(d)恰好是连结抗体的两个Fab段与之结合的长度，于是连结抗体不存在游离Fab段，仅剩无活性的Fc段，所以不能将PAP复合物连结在与组织抗原结合的第一抗体上，结果阴性(图4-8)。因此，借助PAP法研究组织抗原分布，特别是新鲜组织冰冻切片组织抗原保存较好时，第一抗体尽量用高稀释度，避免假阴性。石蜡切片很少发生这种现象，所以PAP法在石蜡切片的ICC观察中更为常用。

图4-8　示假阴性：组织切片上结合过多的第一抗体，两抗体间的距离d 恰好适于桥抗体的两个Fab段与之结合，无PAP复合物结合的位置

(5)桥抗体：也称连结抗体，它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力。因此，当第一抗体和PAP复合物中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个Fab段之一与第一抗体结合、另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白A(SPA)代替桥抗体，进行ICC染色。SPA不受种属限制，应用范围广。

(6)PAP复合物：在PAP法及酶桥法中，特别强调第一抗体和抗HRP抗体必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起;但一些研究表明：第一抗体和抗HRP抗体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如Erlandsen发现豚鼠IgG作为第一抗体，可用羊抗兔IgG、兔PAP复合物显示之一。Grzanna(1982)根据这一报告，利用豚鼠抗DBH血清作第一抗体，羊抗兔IgG为桥抗体，12例兔血清制得的PAP复合物中，仅3例染色较佳。这种第一抗体和PAP复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体和种属交叉反应是有限的，也是不完全的。故利用桥抗体进行ICC染色时，仍以第一抗体和抗酶抗体来自同一种属为宜。