免疫琼脂双向扩散实验原理、方法与结果观察

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可溶性抗原 与相应抗体持异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应 (precipitation ) 。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。与相应的抗体相比，抗原分子小 ( < 20pm) ，单位体积中所含抗原量多，具有较大的反应面积。为了使抗原抗体之间比例适合，不使抗原过剩，故一般均应稀释抗原，并以抗原最高稀释度仍能与抗体出现沉淀反应为该抗体的沉淀反应效价 ( 滴度 ) 。

琼脂 扩散( agar diffusion )为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应。当对应的抗原、抗体在半固体琼脂终相遇，且二者比例适当时，便出现可见的白色沉淀线，这组沉淀线是一组抗原、抗体的特异性复合物。当琼脂中有多组不同的抗原、抗体存在时，便各自依其扩散速度的差异，再适当的部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散不仅用于疾病的诊断，更广泛地用于抗原成分的分析。

免疫 琼脂双向扩散是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生待异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线 ( 图 5-1) 。如果所加抗原和抗体标本中分别含有若干与血清学反应无关的抗原抗体，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线， — 条沉淀线代表一对抗原抗体。因此，通过双向免疫扩散试验，用已知抗体 ( 或抗原 ) 检测未知抗原 ( 或抗体 ) ，可鉴定抗原性物质或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。

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图 5-1 双向免疫扩散试验示意图

左图为模式图，右图为实际试验的结果。上，两个抗原孔里含有相同的抗原，沉淀线是不分叉的;中，两个抗原孔里的抗原完全不同，沉淀线分叉;下，两个抗原孔里的抗原部分相同，沉淀线部分交叉。

【材料】

1. 1 %生理盐水琼脂。

2.人血清( 1 ： 20 )，兔抗人 IgG 。

3.载玻片、琼脂板打孔器、微量加样器等。

【方法】

1.琼脂板的制备：将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂 4ml ，倾注于载玻片上，使其自然流成水平面。待琼脂凝固后，用打孔器按图 6-2 打孔，孔径 3mm ，孔距距 15mm 。

2.加样： 于中央孔加入人血清，周围 1-5 孔加入不同浓度的兔抗人 IgG ， 6 孔加入生理盐水作对照。

3.扩散 将琼脂板放入湿盒内置 37c 温箱中 24 小时后取出观察结果。

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图 5-2 免疫琼脂双向扩散打孔图

【结果观察】

观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验 1 至 5 孔( 1 ： 2 、 1 ： 4 、 1 ： 8 、 1 ： 16 和 1 ： 32 的人抗兔 IgG )与中央孔 ( 人血清 ) 之间可出现清晰的乳白色沉淀线(图 6-3 )沉淀线。沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。

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图 6-3 双向免疫扩散试验结果示意图。

【注意事项】

1. 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。

2. 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性、不出现或不清楚。

3 .加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆，影响试验结果。

4 .试验前应做预试验，确定抗体的稀释度。

【作业】

1. 记录免疫琼脂双向扩散的实验结果。

2. 说明凝集反应与沉淀反应的区别。