分子免疫学技术-125I标记单克隆抗体竞争结合试验

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单克隆抗体(McAb)与各种标记技术相结合成为研究细胞分化抗原 、活化抗原和各种受体的重要手段。常用方法有免疫荧光技术、流式细胞仪(FCM)、犆8免疫组化技术以及免疫沉淀、SDS-PAGE分析等。125I标记单克隆抗体进行竞争结合试验，可以计算出每个细胞表面平均抗原数量以及抗原抗体结合的亲和力，是分子免疫学中一种重要的研究方法。

(一)　原理

125I标记的单克隆 抗体能与具有相应抗原的细胞结合，犜Z有数百倍以上未标记的特异性抗体同时存在的条件下，则标记抗体的结合受到竞争性抑制。根据不同稀释度抗体分别与相同数量细胞结合后所测得的特异性计数值，可以计算出每个细胞表面的平均抗原密度以及抗原和抗体的亲和力。

(二)　操作步骤

                                硅化规格相同的5ml玻璃管，双蒸水冲净后烤干，
　　　　　　　　每次实验分6～12组，每组5支试管
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　　　　　　　　将１２５I标记抗体和非标记抗体分别用结合缓冲液作
　　　　　　　　倍比稀释
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　　　　　　　　在同一组5个试管中每管加入10μl标记抗体，4、
　　　　　　　　5管加入10μl未标记抗体(浓度高于同组标记抗体
　　　　　　　　100倍以上)，1、2、3管补加10μl结合缓冲液
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　洗涤分离或培养的细胞，用结合缓冲液调整细
　　　　　　　　胞浓度为5×10５～1×10６／80μl，每管中加入
　　　　　　　　80μl细胞悬液
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　　　　　　　　轻轻振摇后在4℃条件下(冷室或冰浴上)
　　　　　　　　孵育30min
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　　　　　　　　将孵育后的细胞悬液叠加于预先置小塑料
　　　　　　　　管内的200μl分离液上
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　　　　　　　　　　台式高速离心机 10,000g 2min
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　　　　　　　　　　　切下位于管底细胞小团
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　　　　　　　　　　　　　　　γ计数

计算:

1.　特异性计数值=总计数值(每组1、2、3管平均cpm值)-非特异性计数值(每组4、5管平均cpm值)。

2.　结果用LIGAND和EBDA微机程序进行Scatchad分析，计算出细胞表面抗原密度以及抗原与抗体结合的亲和力。

(三)　试剂器材

1.　分离或长期培养的细胞

2.　125I标记的McAb、未标记抗体

3.　结合缓冲液(binding buffer: RPMI1640, PH7.2，1%BSA，20mM Hepes)

4.　细胞分离液80% Silicone oil/20% paraffion oil

5.　试管、塑料管、高速台式离机

6.　Prosil-28硅化油

(四)　注意事项

1.　每管所需要细胞数根据细胞种类而定，一般在5×105～1×106/管，若用血小板可用1×108/管。

2.　所用McAb要求纯度好、活性高。用氯胺-T法标记抗体时，氯胺-T作用时间不要超过30秒，比活性以3～6μci/μg McAb为宜，标记率在50～70%，犚T保持125I标记后McAb的结合活性。

3.　细胞、抗体等计数、取样要精确。

4.　孵育时间和温度视竞争结合试验所用细胞和抗体的不同有所差别，可在室温或37℃条件下进行，孵育时间30min～4h不等。

5.　在整个操作过程中防止未标记抗体对只加标记抗体管的污染，否则会使整个实验失败。