PPO活性测定的原理方法与结果分析

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一、原理与方法

PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计 410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

其方法是：在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位(U)。

二、仪器与试剂

(1)样品：

多酚氧化酶粗酶液

硫酸铵沉淀组分

DE-52洗脱组分

葡聚糖凝胶洗脱组分

(2)底物：

邻苯二酚：O.01M邻苯二酚溶液

(3)反应体系：

0.2M邻酸二氢钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8

(4)器皿与仪器：

试管、恒温水浴等

分光光度计

三、酶蛋白的比活性

比活性=酶活单位(U)/mg蛋白质

四、实验结果与分析

1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410)

结果列表

试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.16 0.09

粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。

2. DE-52的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410)

结果列表

试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

空白 0 0 3 0.03 0.05

粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。