动物细胞融合实验

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一、实验目的
细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞均能发生自发融合现象。人工方法诱导细胞融合开始于50年，现在这项技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫 ，肿瘤及细胞工程的重要手段。通过实验，了解细胞融合的原理，掌握细胞融合的基本方法。
二、实验原理
在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，最后打通两质膜，形成双核或多核细胞（此时称同核体或异核体）。通过有丝分裂，细胞核 便发生融合，形成杂种细胞。
三、实验用品
1. 器具 显微镜 离心机 天平 离心管 注射器 细滴管 载片、盖片
2. 试剂 50%聚乙二醇(PEG)：称取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度试管，在酒精灯火或沸水中加热溶化。待冷至50℃时，加入等体积并预热至50℃的GKN液混匀。
Alsver液：葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。
GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4?2H2O 1.77g，NaH2PO?2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml重蒸水中。
0.85%NaCl液
3. 材料 一龄公鸡静脉血
四、实验内容及方法
1. 用注射器取2ml Alsver液，再从翼下静脉取鸡血2ml，注入试管内，再加6ml Alsver液，混匀后置4℃冰箱中可备作3—4天用。
2. 实验时取“1”液1ml于离心管中，加入4ml 0.85%的NaCl液，混匀平衡后以1200r/min离心5分钟。
3. 去上清液。再重复“2”两次，最后一次离心10分钟。
4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混匀使之成为细胞悬液。（可加GKN液调节稀释使每立方毫米含红细胞3~4万个）。
5. 在“4”液中加入6—8滴（约0.5ml）50%的PEG液，迅速混匀，常温下2~3min滴片镜检。
观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。
6. 计算融合率：
融合率=