电子显微镜生物标本的制备及观察

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【实验目的】
了解电子显微镜 的基本原理及电镜生物标本的制备方法和观察。
【实验用品】
一、材料和标本 家兔一只。
二、器材和仪器 H—600透射电子显微镜、S—450扫描电子显微镜、超薄切片机(AO型)、解剖镜、震荡器、恒温箱、临界点干燥器、JB一3型离子镀膜机、单面刀片、铜网、解剖器材。
三、试剂 乙醚、2.5％戊二醛(0.1mol／L(pH7.4)二甲砷酸钠缓冲液配制)、1％锇酸、30％、50％、70％乙醇溶液、80％、90％、95％、100％丙酮溶液、环氧树脂(Epon812)包埋剂、醋酸铀染液、柠檬酸铅染液、双蒸水、2％单宁酸、乙酸异戊脂、液态CO2。
【实验内容】
一、透射电子显微镜的标本制备及观察
(一)原理 电子显微镜是细胞生物学研究的重要工具，它以电子束为照明源，利用电子流具有波动的性质，在电磁场的作用下，电子改变前进轨迹，产生偏转、聚焦，因而电子束透过标本后在电磁透镜的作用下可放大成像。高速运动的电子流其波长远比光波波长短，所以电镜分辨率远比光镜高，可达0.14nm，放大倍率可达80万倍。由热阴极发射的电子在20～100千伏加速龟压作用下，经聚光镜聚焦成束，投射到很薄的标本上，并与标本中各种原子的核外电子发生碰撞，造成电子散射，在细胞质量和密度较大的部位，电子散射度强，成像较暗。在质量、密度较小处电子散射弱，成像较亮，结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的黑白图像。
(二)主要结构 电子显微镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成(图17一l，图17—2)。
1．电子光学系统是电镜的主体，对成像和像的质量起着决定性作用。它是由电子枪、聚光镜、样品室、物镜、中间镜、投影镜、观察室和照像室等部分构成。
2．真空系统主要是使镜筒内保持高度真空，一般要求达到10-4托（1托=lmmHg），是通过机械泵和油扩散泵接力排气及真空垫圈的密封作用来实现的。真空度可由真空表指示。由于电镜利用高速电子束为照明源，裁要求在电子束的通道上不能有游离气体存在，以免与气体分子 碰撞引起电离、放电、电子散射、灯丝氧化、样品被污染等而影响观察效果或发生故障。
3．供电系统主要是提供稳定的电源，包括高压系统电源、各透镜的电源及真空泵的电源等。
(三)透射电镜生物标本超薄切片的制备(以家兔肝脏为例)。
1．取材 取活兔用乙醚麻醉，迅速打开腹腔，暴露肝脏，用锋利的刀片切取lmm3肝组织，立即投入固定液中。取材要求迅速，通常将动物麻醉取材。如动物处死后取材，要在几分钟内完成。取材最好在低温条件下进行(0～4℃)，以防止动物死后细胞缺氧发生超微结构变化。

图17—1 透射电镜结构
2．固定 把肝组织立即投入到0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5％戊二醛中，4℃固定二小时(也可用0.1mol／L(pH7.4)的磷酸缓冲液 配制的2.5％戊二醛)。然后用0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液洗三次，再放入用相同缓冲液配制的1％锇酸中固定2小时(4℃)。固定的作用是用化学试剂使细胞的微细结构如同生前状态精确地保存下来。固定剂应能迅速进入细胞，稳定细胞结构，使其不变形，在脱水过程中不丢失细胞成分。