电子显微镜生物标本的制备及观察

【实验目的】
了解电子显微镜的基本原理及电镜生物标本的制备方法和观察。
【实验用品】
一、材料和标本 家兔一只。
二、器材和 仪器 H—600透射电子显微镜、S—450扫描电子显微镜、超薄切片机(AO型)、解剖镜、震荡器、恒温箱、临界点干燥器、JB一3型离子镀膜机、单面刀片、铜网、解剖器材。
三、 试剂 乙醚、2.5％戊二醛(0.1mol／L(pH7.4)二甲砷酸钠缓冲液配制)、1％锇酸、30％、50％、70％乙醇溶液、80％、90％、95％、100％丙酮溶液、环氧树脂(Epon812)包埋剂、醋酸铀染液、柠檬酸铅染液、双蒸水、2％单宁酸、乙酸异戊脂、液态CO2。
【实验内容】
一、透射电子显微镜的标本制备及观察
(一)原理 电子显微镜是细胞生物学研究的重要工具，它以电子束为照明源，利用电子流具有波动的性质，在电磁场的作用下，电子改变前进轨迹，产生偏转、聚焦，因而电子束透过标本后在电磁透镜的作用下可放大成像。高速运动的电子流其波长远比光波波长短，所以电镜分辨率远比光镜高，可达0.14nm，放大倍率可达80万倍。由热阴极发射的电子在20～100千伏加速龟压作用下，经聚光镜聚焦成束，投射到很薄的标本上，并与标本中各种原子的核外电子发生碰撞，造成电子散射，在细胞质量和密度较大的部位，电子散射度强，成像较暗。在质量、密度较小处电子散射弱，成像较亮，结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的黑白图像。
(二)主要结构 电子显微镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成(图17一l，图17—2)。
1．电子光学系统是电镜的主体，对成像和像的质量起着决定性作用。它是由电子枪、聚光镜、样品室、物镜、中间镜、投影镜、观察室和照像室等部分构成。
2．真空系统主要是使镜筒内保持高度真空，一般要求达到10-4托（1托=lmmHg），是通过机械泵和油扩散泵接力排气及真空垫圈的密封作用来实现的。真空度可由真空表指示。由于电镜利用高速电子束为照明源，裁要求在电子束的通道上不能有游离气体存在，以免与气体分子碰撞引起电离、放电、电子散射、灯丝氧化、样品被污染等而影响观察效果或发生故障。
3．供电系统主要是提供稳定的电源，包括高压系统电源、各透镜的电源及真空泵的电源等。
(三)透射电镜生物标本超薄切片的制备(以家兔肝脏为例)。
1．取材 取活兔用乙醚麻醉，迅速打开腹腔，暴露肝脏，用锋利的刀片切取lmm3肝组织，立即投入固定液中。取材要求迅速，通常将动物麻醉取材。如动物处死后取材，要在几分钟内完成。取材最好在低温条件下进行(0～4℃)，以防止动物死后细胞缺氧发生超微结构变化。

图17—1 透射电镜结构
2．固定 把肝组织立即投入到0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5％戊二醛中，4℃固定二小时(也可用0.1mol／L(pH7.4)的磷酸缓冲液配制的2.5％戊二醛)。然后用0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液洗三次，再放入用相同缓冲液配制的1％锇酸中固定2小时(4℃)。固定的作用是用化学 试剂 使细胞的微细结构如同生前状态精确地保存下来。固定剂应能迅速进入细胞，稳定细胞结构，使其不变形，在脱水过程中不丢失细胞成分。