细菌原生质体融合

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一、目的要求
了解原生质体融合技术的原理。
学习并掌握以细菌 为材料的原生质体融合技术。

二、基本原理
原核微生物 基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。
(一) 原生质体融合的优点
(1) 克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。
(2) 基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 (包括细胞核 、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。
(3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。
(4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。
(二) 原生质体融合步骤
(1) 选择亲本 选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。
(2) 制备原生质体 经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。
(3) 促融合 聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。
(4) 原生质体再生 原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。
(5) 检出融合子 利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。
(6) 融合子筛选 产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。
(三) 原生质体再生率和融合率计算

三、实验材料
(一) 菌种
枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-
(二) 培养基(见附录)
(1) 完全培养基(CM，液体)；
(2) 完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂；
(3) 基本培养基(MM)；
(4) 补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min；
(5) 再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。
(6) 酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。
(三) 缓冲液
(1) 0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融合剂
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液。
(六) 溶菌酶液
酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用。
(七)器皿
培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比
色计、细菌过滤器。