红细胞膜的制备及其成份分析(磷脂、胆固醇)

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一、红细胞膜 的制备
(一)原理
随着生物膜研究的迅速发展，在膜的结构及功能的研究中分离和鉴定生物膜常常是必要的。为进行膜结构的生物化学分析，必须首先分离出纯净的细胞膜。
哺乳动物的红细胞膜在分离状态下。一般称为”血影”，其没有通常真核生物细胞内所含有的任何细胞器 ，经过制备，容易得到纯粹的细胞膜，并且在取材方面来源方便，因此哺乳动物的红细胞膜是研究细胞膜的好材料。
从哺乳动物 红细胞中分离细胞质膜，第一步，将血液取放在加有抗凝剂的容器内，用低速离心的方法从血液中分离出红细胞，然后用等渗缓冲液重复洗涤多次，去除血浆。第二步，将洗净的红细胞从等渗缓冲液转移到低渗缓冲液中，由于渗透压力作用于细胞质膜，使红细胞膨胀而溶血。最后一步，将溶血的红细胞经过充分反复洗涤．高速离心，去除血红蛋白和其他细胞内含物。这样制备所获得的最终产品几乎全是红细胞膜。
(二)仪器、试验材料和试剂
仪器
冷冻离心机、冰箱、自动移液管、相差显微镜、冷冻干燥机等。
原料
哺乳动物的血液
试剂
1. pH7.4等渗磷酸盐缓冲液(含有0.15mol/L 氯化钠的5mL，pH7.4磷酸盐缓冲液)：
贮液A：称取0.7808磷酸二氢钠溶于水，定容至1000mL；
贮液B：称取3.5828磷酸氢二钠溶于水，定容至2000mL；
取380mL 贮液A 加1620mL 贮液B，用少量浓盐酸调PH 至7.4．再称取17.5g 氯化钠加入其中。
2. pH7.4低渗tris 缓冲液(10mmol/LpH 7.4Tris-盐酸缓冲液)：
贮液A：称取2.42gTis，溶于水，稀释至500mL；
贮液B：取0.84mL36％一38％盐酸，稀释至100mL；
取500mL 贮液A 加414mL 贮液B，用水稀释至近于2000mL，用6mol/L 盐酸调pH7.4，再定容到2000mL。
3. 肝素－PH7.4等渗磷酸盐缓冲液：
将肝素溶于PH7.4低渗Tris 缓冲液中，使每毫升含肝素500单位。
(三)操作步骤
1.血液的收集及洗涤
将血液收集在含有抗凝剂的容器中，每30mL 血液加约5mL 肝素－pH7.4等渗磷酸盐缓冲溶液。
为避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白发生变化，以下操作应在－4℃低温下进行。取30mL血液，于冷冻离心机(4℃)中3000r/min 离心20min，使红细胞沉淀，用吸管吸尽血浆及沉淀的红细胞表层的绒毛状沉淀层，以避免其他类型细胞的混入。
将红细胞置于3倍量预冷的pH7.4等渗磷酸盐缓冲液中，用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮，4℃5000r/min离心15min，除去上清液及沉淀表层，重复洗涤3次。
2.溶血和红细胞膜的洗涤
在洗净的红细胞中，按照1:40的比例加入预冷的10mmol/LpH7.4低渗Tris(三羟甲基氨基甲烷)－HCl 缓冲液，边加边缓慢搅拌，置于4℃冰箱中1～2h，使之完成溶血。然后于4℃9000r/min 离心15min，使红细胞膜沉淀。重复洗涤、离心3～5次，最后获得白色的红细胞膜样品。
注意：①溶血时低渗缓冲液的用量越大，红细胞膜中血红蛋白的残留量越少，但体积大，离心费时间。因此，红细胞与缓冲液的容量比例，以1:40为宜。②膜的重量很轻，在溶血后离心倾倒上清液时容易流走，因此要特别小心，尽可能防止膜的损失。③在制备过程中，若pH 值降低，残留的血红蛋白会迅速增加。当pH 保持在7.4时，红细胞膜中的血红蛋白含量仅占总蛋白量的3~5％，相当于血液中总血红蛋白的0.1％。但pH 值降低至7.0时，血红蛋白增加至20％。④上述方法适用于大白鼠和人红细胞膜的分离。牛、猪等红细胞膜的制备，若反复进行低渗处理，将造成膜外表面包含具有乙酰胆碱酯酶活性的酯蛋白脱落，使膜容易破碎，得不到较完整的膜样品。若在低渗缓冲液中加入1mmoL氯化钙，即可完全防止这种膜的不稳定性。
将最后一次离心所得到的红细胞膜悬浮在2～4mLpH7.4等渗磷酸盐缓冲液中。记录悬浮液的总体积。注意，有时在膜的下面有少许未解体的红细胞残留物，不要将这部分残留物悬浮在缓冲液中。