X和Y染色质标本的制作与观察
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【实验目的】
熟悉X染色质和Y染色质的形态特征及其检查方法
【实验原理】
正常女性核型为46，XX。在间期细胞核 中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即X染色质，这是女性细胞中一条X染色体随机Lyon化失活形成的。这种失活保证了雌雄两性细胞中都只有一条有活性的染色体，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。称为X染色体的剂量补偿（参考Lyon假说）。
正常男性核型为46，XY。在男性间期细胞核中，可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点，就是Y染色质（Y小体），大小约0.25～0.3μm。是Y染色体 长臂特异性着色而形成。
人的性别是由X和Y染色体决定的。需要对人的性别进行鉴定时，除进行染色体核型分析和临床生殖器官的检查外，还可以通过细胞学方法，如检查期间体细胞（口腔上皮，皮肤，羊水和血细胞等）的核内染色质——X和Y染色质来鉴定。
【实验用品】
显微镜、荧光显微镜 、乙醇(无水乙醇,95％,70％、50％)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1％结晶紫，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦镜纸、盖玻片、载片、15ml刻度离心管、牙签、吸水纸、小镊子、碘酒、酒精棉球、采血针、3％醋酸溶液、pH6～6.5缓冲液、0.5％盐酸阿的平染液。
（注：硫堇染液(工作液)，①干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后过滤备用；②醋酸钠缓冲液：醋酸钠·3H2O 9.7g，巴比妥钠14.7g，溶于500mL蒸馏水中；③0.1 mol／L盐酸；按①：②：③=40：28：32比例配成混合液，调pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。）
【实验步骤】
一、X染色质的制备和观察
（一）取材
1. 让受检者用水漱洗口腔数次，以尽量除去口腔内细菌或其它杂物。
2. 用牙签钝头部或木质器具刮取口内侧面的口腔粘膜上皮，弃去第一次刮到的细胞。
3. 同一部位连续刮取数次，将刮取物涮入装有生理盐水的离心管内。
（二）标本的制作
1. 将细胞悬液的离心管进行离心（1 500 rpm）10分钟，去上清液，留下细胞团。
2. 加入新配制的固定液（3份甲醇︰1份冰醋酸）8mL，混匀呈悬液。固定30分钟。
3. 离心（同上），去上清液，留下细胞团。
4. 加入数滴（根据细胞多少而增减）固定液，充分混匀呈悬液。
5. 滴一滴悬液至预先置冰盒中的干净载玻片上，晾干。每份样本制片3—4张。
（三）染色
Klinger硫堇染色法
1. 将玻片标本置入1mol/L HCl中，37℃条件下水解20分钟。
2. 用蒸馏水充分冲洗、晾干。
3. 硫堇染液中染色约15分钟。
4. 蒸馏水冲洗、晾干。
硫堇染色的优点是只有细胞核清晰着色，胞浆不着色，因此细胞核背景清晰，利于对位于核膜边缘的X染色质的辨认。
结晶紫的染色法
1. 固定后的玻片标本经过70％、50％酒精及蒸馏水（更换两次蒸馏水）各5分钟。
2. 置入1％结晶紫溶液中染色5～8分钟。大量制片时可用0.5％结晶紫染液，染色10～15分钟左右。
3. 95％酒精中分化（快速地在酒精中沾5～8次）。
4. 继续在无水乙醇中分化，间歇地用显微镜检查，直至标本中核结构的微细部分都很清楚为止（一般约1分钟）。
5. 置入二甲苯中。更换2次二甲苯，每次3分钟，以使标本透明。
6. 树胶封片。
（四）观察
1.先在低倍镜(10倍镜)下观察，可见视野中有许多单个或成堆的口腔上皮细胞。选择清楚而分散的细胞，移至视野中央，再换高倍镜仔细观察。口腔上皮细胞为多边形的扁平状，细胞中央有一被染成深兰色的圆形或椭圆形的细胞核。核周围均质部分为细胞质。细胞的外表为一很难与细胞质相区别的薄膜即细胞膜。
2. 40倍或油镜下检查100个“可计数细胞”，并计数具有X染色质的细胞数。
二、Y染色质的制片与观察
（一）制作标本
1. 采血与涂片：男同学用碘酒，酒精棉球常规消毒食指或耳垂后，用采血针点刺食指或尖或耳垂，挤出2～3滴血于一干净的底玻片中央，用牙签将血滴涂成较厚的一层血膜，直径约1.5cm，晾干。
2. 固定：加3％的醋酸溶液数滴于血膜上，静置15分钟，其间可换液一次，使红细胞溶解。
3. 用pH6～6.5磷酸缓冲液冲洗血膜，晾干。
4. 染色：加0.5％盐酸阿的平溶液数滴于血膜上，放置暗处静置染色15分钟。（若使用口服阿的平片剂，则用100mg溶于10ml双蒸水中，染色时间为25分钟）。
5. 再用磷酸缓冲液冲洗黄色溶液。
6. 加盖玻片，在有缓冲液的情况下，用荧光显微镜进行观察。
（二）观察Y染色质
先在低倍镜下观察，可见许多白细胞（多为淋巴细胞）核染成黄色。换高倍镜，可见位于细胞核边缘或核中央处有一极小的黄色荧光亮点，就是Y染色质（Y小体），大小约0.25～0.3μm。最后可用油镜再仔细观察。Y染色质在男性白细胞的出现率可达60～70％。注意需要计数的细胞必须是核膜完整无缺，核质染色均匀，清晰可见，核周围无细菌和其它污染物质的干扰。
【实验结果与分析】
观察并计算X染色质的阳性率。X染色质的标准是：
1. 位于核膜内缘。
2. 核内唯一的浓染、轮廓清楚的小体，直径约为1～1.5μm,一般呈平凸形、圆形、扁平形或三角形。
(注：配制的pH6～6.5的磷酸缓冲液要用黑纸或茶色瓶置于冰箱保存，有效期一个月。)
