染色体的标本制作及其组型实验

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实验三 染色体 的标本制作及其组型实验

 

 

长期以来，在真核生物中, 染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA的载体, 对生物的遗传、变异、进化和个体发生, 以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核 中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型(karyotype)或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者A.Levan合作, 利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条，而不是前人所主张的48条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。

 

实 验 目 的

 

1. 通过实验，初步掌握染色体标本的制做方法，进一步了解各操作步骤的原理

2. 通过组型实验，掌握染色体组型的基本方法

 

实 验 原 理

 

自身正处于活跃分裂状态或用植物 血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)处理后处于分裂状态的组织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织，可不经PHA处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。

对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。

染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数: 1. 相对长度(relative length): 指单个染色体的长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X染色体)的总长度×100%。2. 臂指数(arm index): 指染色体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。3. 着丝粒指数(centromere index): 指短臂占整个染色体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%, 该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。4. 染色体的臂数: 对于端部着丝粒染色体，臂数为1，其它为2。根据Levan(1964)所制定的人类染色体标准，臂指数在1.0~1.7之间的染色体为中央着丝粒染色体，在1.7~3.0之间为亚中央着丝粒染色体，在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染色体，大于7.0为端部着丝粒染色体；着丝粒指数在50.0~37.5之间的染色体为中央着丝粒染色体，在37.5~25.0之间为亚中央着丝粒染色体，在25.0~12.5之间为亚端部着丝粒染色体，小于12.5为端部着丝粒染色体。

实 验 用 品

 

一、材料 小白鼠，蟾蜍

二、器材

普通离心机，恒温水浴，手术剪和手术镊各20把，100ml量筒5个，滴管20支，10ml小烧杯5个，10ml刻度离心管20支，试管架5个，染色用玻璃板5块, 载、盖片各20片；显微镜20台, 香柏油5瓶，擦镜纸5本，直尺20把，复印的染色体标本图20页。

三、试剂

1. 秋水仙素: 称取秋水仙素10mg加10ml的注射用水，即得0.1%的秋水仙素液, 以此作为原液。在使用时，需将原液稀释50倍，即取0.1ml原液，加4.9ml注射用水，稀释后秋水仙素的浓度为 20蔳/ml。

2. 生理盐水: 哺乳动物及人类为0.9%的NaCl溶液，两栖类为0.7%的NaCl溶液。

3. Carnoy"s固定液；甲醇:冰醋酸为3:1, 必须现用现配。

4. Giemsa染液的配制；

吉姆萨粉(Giemsa stain)

l.0g

甘油(AR)

66ml

甲醇(AR)

66ml

 

将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。

5. 磷酸缓冲液；

1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O: 2.39g 溶于100ml双蒸水中。

1/15 mol/L KH2PO4 0.907g 溶于100ml双蒸水中。

取1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O液80ml、1/15 mol/L KH2PO4液 20ml混合即为pH=7.38之磷酸缓冲液。

如用无水Na2HPO4配制磷酸缓冲液，还可用以下方法配制；

A液:

Na2HPO4 9.47g

双蒸水 1000ml

B液:

KH2PO4 9.06g

双蒸水 1000ml

根据下表中所示比例即可配制出不同pH值的磷酸缓冲液。

表1 磷酸缓冲液配制比例

pH值

A液(ml)

B液(ml)

5.8

7.8

92.2

6.0

12.0

88.0

6.4

26.5

73.5

6.6

37.5

62.5

6.8

50.0

50.0

7.0

61.1

38.9

7.2

71.5

28.5

7.4

80.4

19.6

 

6. 0.3% KCl水溶液（低渗液）。

 

实 验 方 法

 

一、 染色体标本的制做

取小白鼠注射秋水仙素

↓14~16h后

断头法杀死，取睾丸洗净血污

↓

移入KCl的低渗溶液内将睾丸剪碎(呈乳白色)

↓铜网过滤至刻度离心管中

加入KCl低渗溶液于37℃水浴中低渗处理30min（使细胞膨胀）

↓

800~1000r/min离心8min

↓轻轻地去除上清液

加入新配制的Carnoy"s固定液，立即用吸管轻轻将细胞吹散

↓

室温固定8min

↓

800~1000r/min离心8min

↓弃去上清液

加入新制Carnoy"s固定液，用滴管轻轻将细胞吹散，制成细胞悬液

↓

取出预冷的干净载玻片，以10~15cm高度滴加细胞悬液（细胞胀破）

↓

立即吹打载玻片

↓

多余的水分吸去后用文火烤干或空气干燥

↓

稀释Giemsa原液

Giemsa染色（倒置染色法，后有说明）30min

↓

用流水冲洗标本载玻片

↓

文火烤干显微观察

↓

选择染色好的分裂相染色体封片后油镜下进行显微照相