染色体的标本制作及其组型实验
互联网
- 相关专题
长期以来，在真核生物中, 染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA的载体, 对生物的遗传、变异、进化和个体发生, 以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核 中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型(karyotype)或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者A.Levan合作, 利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条，而不是前人所主张的48条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。
实 验 目 的
1. 通过实验，初步掌握染色体 标本的制做方法，进一步了解各操作步骤的原理
2. 通过组型实验，掌握染色体组型的基本方法
实 验 原 理
自身正处于活跃分裂状态或用植物 血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)处理后处于分裂状态的组织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织，可不经PHA处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。
对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。
染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数: 1. 相对长度(relative length): 指单个染色体的长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X染色体)的总长度×100%。2. 臂指数(arm index): 指染色体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。3. 着丝粒指数(centromere index): 指短臂占整个染色体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%, 该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。4. 染色体的臂数: 对于端部着丝粒染色体，臂数为1，其它为2。根据Levan(1964)所制定的人类染色体标准，臂指数在1.0~1.7之间的染色体为中央着丝粒染色体，在1.7~3.0之间为亚中央着丝粒染色体，在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染色体，大于7.0为端部着丝粒染色体;着丝粒指数在50.0~37.5之间的染色体为中央着丝粒染色体，在37.5~25.0之间为亚中央着丝粒染色体，在25.0~12.5之间为亚端部着丝粒染色体，小于12.5为端部着丝粒染色体。
实 验 用 品
一、材料 小白鼠，蟾蜍
二、器材
普通离心机，恒温水浴，手术剪和手术镊各20把，100ml量筒5个，滴管20支，10ml小烧杯5个，10ml刻度离心管20支，试管架5个，染色用玻璃板5块, 载、盖片各20片;显微镜20台, 香柏油5瓶，擦镜纸5本，直尺20把，复印的染色体标本图20页。
三、试剂
1. 秋水仙素: 称取秋水仙素10mg加10ml的注射用水，即得0.1%的秋水仙素液, 以此作为原液。在使用时，需将原液稀释50倍，即取0.1ml原液，加4.9ml注射用水，稀释后秋水仙素的浓度为 20蔳/ml。
2. 生理盐水: 哺乳动物及人类为0.9%的NaCl溶液，两栖类为0.7%的NaCl溶液。
3. Carnoy"s固定液;甲醇:冰醋酸为3:1, 必须现用现配。
4. Giemsa染液的配制;
将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。
5. 磷酸缓冲液;
1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O: 2.39g 溶于100ml双蒸水中。
1/15 mol/L KH2PO4 0.907g 溶于100ml双蒸水中。
取1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O液80ml、1/15 mol/L KH2PO4液 20ml混合即为pH=7.38之磷酸缓冲液。
如用无水Na2HPO4配制磷酸缓冲液，还可用以下方法配制;
A液:
Na2HPO4 9.47g
双蒸水 1000ml
B液:
KH2PO4 9.06g
双蒸水 1000ml
根据下表中所示比例即可配制出不同pH值的磷酸缓冲液。
表1 磷酸缓冲液配制比例
| pH值 | A液(ml) | B液(ml) |
| 5.8 | 7.8 | 92.2 |
| 6.0 | 12.0 | 88.0 |
| 6.4 | 26.5 | 73.5 |
| 6.6 | 37.5 | 62.5 |
| 6.8 | 50.0 | 50.0 |
| 7.0 | 61.1 | 38.9 |
| 7.2 | 71.5 | 28.5 |
| 7.4 | 80.4 | 19.6 |
实 验 方 法
一、 染色体标本的制做
稀释Giemsa原液
Giemsa染色(倒置染色法，后有说明)30min
↓
取小白鼠注射秋水仙素
↓14~16h后
断头法杀死，取睾丸洗净血污
↓
移入KCl的低渗溶液内将睾丸剪碎(呈乳白色)
↓铜网过滤至刻度离心管中
加入KCl低渗溶液于37℃水浴中低渗处理30min(使细胞膨胀)
↓
800~1000r/min离心8min
↓轻轻地去除上清液
加入新配制的Carnoy"s固定液，立即用吸管轻轻将细胞吹散
↓
室温固定8min
↓
800~1000r/min离心8min
↓弃去上清液
加入新制Carnoy"s固定液，用滴管轻轻将细胞吹散，制成细胞悬液
↓
取出预冷的干净载玻片，以10~15cm高度滴加细胞悬液(细胞胀破)
↓
立即吹打载玻片
↓
多余的水分吸去后用文火烤干或空气干燥
↓
用流水冲洗标本载玻片
↓
文火烤干显微观察
↓
选择染色好的分裂相染色体封片后油镜下进行显微照相
[附]：倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架, 使标本载玻片的标本面向下放置到支架上, 在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙;滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。
二、染色体的组型实验
1. 选择染色体清晰的照相底片，用放大机制作出放大10倍的清晰照片。
2. 将染色体逐一剪下，并对每个中期染色体逐一进行测量，包括每条染色体的长度和每个臂的长度。
3. 根据测量数据，计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数。
4. 把相对长度与臂指数相近者配成一对。
5. 参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值，并根据标准顺序，编排出染色体组型图。
6. 用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。
实 验 结 果
在显微镜下，染色体被染成紫红色，胞浆完全不着色。对于分散好的染色体, 其间相互散开, 短臂收缩适中, 二条姐妹染色单体大致平行分离, 着丝粒清晰可见。小鼠的染色体数为40条，多为端部和亚端部染色体，只有2对亚中部着丝粒染色体。
人类染色体为46条，可分为A、B、C、D、E、F、G七个群，其各自的基本特征见表2。
表2 人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征
| 类别 | 包括染色体的序号 | 主 要 特 征 |
| A群 | 第1~3对 | 体积大，中部着丝粒。第2对着丝粒略偏离中央 |
| B群 | 第4~5对 | 体积大，中部着丝粒。彼此间不易区分 |
| C群 | 第6~12对，X | 中等大小, 亚中部着丝粒。第6对的着丝粒靠近中央, X染色体大小介于第6与7对之间, 第9对的长臂上有一次缢痕, 第11对的短臂较长, 第12对的短臂较短, 彼此间不易区分 |
| D群 | 第13~15对 | 中等大小，近端部着丝粒，有随体。彼此间不易区分 |
| E群 | 第16~18对 | 中等大小。第16对为中央着丝粒，长臂上有一次缢痕；第17、18对为亚中央着丝粒，后者的短臂较短 |
| F群 | 第19~20对 | 体积小，中部着丝粒。彼此间不易区分 |
| G群 | 第21~22对，Y | 第21、22对体积小, 近端着丝粒, 有随体, 长臂常呈分叉状；Y染色体较前者略大, 近端着丝粒, 无随体, 长臂常彼此平行 |
1. 通过对自己制做的小鼠染色体标本观察，总结小鼠染色体的形态特征。
2. 对于分散好的染色体，进行染色体计数。
3. 对于呈非整倍性的染色体标本，分析其形成原因。
4. 认真做好小鼠的染色体组型图。
思 考 题
1. 请你分析一下在本实验中造成染色体标本制做不佳的原因有哪些?
答：1 秋水仙素用量太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。
2 低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂;低渗不足则染色体在一起，分散不开。
3 离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂;反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。
4 固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。
5 载玻片有油脂或冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。
6 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。
7 滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂;过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。
2. 本实验中，对由小鼠精巢而来的染色体标本进行镜检时, 发现染色体数有的为40条，而有的则为20条，为什么?拥有20条染色体的单倍体细胞会是什么细胞?
答：有40条染色体的可能是小鼠的体细胞、精原细胞、精母细胞。有20条染色体的可能是已完成第一次减数分裂的精细胞或精子。之所以同时出现40条和20条染色体，是因为精巢里存在大量正在进行有丝分裂和减数分裂的细胞，用秋水仙素处理后，所有细胞均停止分裂。
3. 从一般意义上讲，染色体标本制做的四大要点是什么?
答：A、植物血球凝集素(PHA)处理获得活跃分裂的细胞;
B、秋水仙素处理可使细胞分裂停止在中期;
C、低渗处理可使染色体分散;
D、空气干燥法可使染色体平铺在载玻片上。
