PEG介导的动物细胞融合技术

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细胞融合(Cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)是指真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。人工的细胞融合开始于20世纪50年代, 60年代到70代作为一门新兴的技术, 发展非常快, 应用范围也极为广泛, 除了同种类细胞间可以融合, 种间远缘细胞也能融合, 细胞与组织不同, 不排斥异类、异种细胞, 动物细胞如此，植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon);来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。

目前, 诱导细胞融合的方法有三种：病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和电激(Zimermann, 1980s)。副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendai virus)和新城鸡瘟病毒，在其被膜中目前发现了两种糖蛋白。较大的一种具有粘附细胞和凝血的作用;较小的一种可介导病毒同宿主细胞融合, 也可诱导细胞与细胞融合，称为融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒诱导细胞融合即是利用病毒的这一特性, 使用时先用紫外线将病毒灭活, 稀释到一定浓度加入到细胞悬液中, 诱导细胞融合。但病毒介导细胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。后两种方法则是利用化学和物理手段，暂时使质膜脂类分子 的有序排列发生改变，待去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便有可诱导相接触的细胞发生融合。总之，这3种方法都是在相互接触的两细胞进行自我修复过程中融合的。

细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单克隆抗体的制备, 核质关系, 体细胞的遗传和发育, 新品种的培养, 免疫 作用, 疾病的治疗和性状的改良, 潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。

实 验 目 的

1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清楚的概念

2. 并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术

实 验 原 理

利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。

利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响。1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比;但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。

本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别;2. 实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞;有二至多个核，定为融合细胞。

实 验 用 品

一、器材

1. 主要设备: 普通离心机、普通光学显微镜

2. 小型器材: 100ml量筒2个, 滴管10支, 10ml刻度离心管20支, 载、盖片各20片

二、材料 新鲜鸡血

三、试剂

1. Alsever液制备

 

葡萄糖(Glucose)	2.05g
枸椽酸钠	0.8g
氯化钠(NaCl)	0.42g
重蒸水	至100ml

2. 0.85%生理盐水液

3. GKN液

 

氯化钠	8g
氯化钾(KCl)	0.4g
Na2 HPO4 ?2H2 O	1.77g
NaH2 PO4 ?H2 O	0.69g
葡萄糖	2g
酚红(phenolred)	0.01g
溶于1000ml重蒸水中。

4. 50% PEG液 (现用现配)

根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。

实 验 方 法

将Alsever液与活鸡翼下鸡血混成1:4悬液 (抗凝效果最佳)

↓

4度冰箱保存

↓

取上述悬液加入生理盐水混匀

↓

1200r/min离心5分钟

↓弃上清

上述离心速率重复离心两次(5min, 10min)

(以达到去除细胞表面粘附物质的目的)

↓弃上清

加入适量GKN液，配成细胞悬液

↓

取悬液以血球计数法计数

↓

再用GKN液将红细胞的浓度稀释

↓

加入 50%的PEG液混匀

↓

吸取1~2滴镜检并计算出融合率

实 验 结 果

经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。

细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示：

在实验中统计融合率时, 要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。

作 业

1. 绘出你所观察到的融合细胞的形态，并计算出细胞融合率。

2. 请你写出细胞融合实验操作中应该注意的有关事项。

思 考 题

1. 细胞融合方法主要有哪几类?各有何优缺点?

答：几类细胞融合方法的优缺点如下：

1病毒介导的细胞融合：优点是对细胞毒性较小，融合细胞易于存活;缺点为使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。

2化学介导的细胞融合：优点是操作简便、快速省时且融合效果好;缺点为PEG对细胞有毒性，处理不好则会直接影响融合细胞的存活率。

3电激法：优点是对细胞无毒性，且操作简单;缺点为它除需要电融合仪外，还要求实验人员接受一定的技术训练。

2. PEG法细胞融合的影响因素有哪些?

答：1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比;但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。

3. 本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞?为什么?

答：本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融合，因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合;但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合方法进行融合实验。