PEG 介导的鸡血细胞融合

细胞融合的方法有生物法、化学法和物理法。化学法常用的是化学诱导剂聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）结合高 pH、高钙离子法。该法操作方便，目前已成为人工诱导细胞融合的主要手段。

PEG 介导的细胞融合的基本原理是利用 PEG 使细胞相互接触部位的膜结构发生重排，加之膜脂双层的相互亲和以及彼此间表面张力的作用，引起相邻质膜在修复时相互合并在一起，导致细胞之间发生融合。PEG 介导的细胞融合率受下述因素影响。

① PEG 的分子量与浓度：分子量及其浓度与融合率成正比；但分子量越大、浓度越高，对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，常用的 PEG 相对分子质量为 1000～4000，浓度为 40％～60％。

② PEG 的 pH 值：pH 值在 8.0～8.2 之间融合效率最高。

③ 融合时的温度：由于生物膜的流动性与温度成正比，在细胞可承受的温度范围内适当提高温度，可提高融合率。

④ 处理时间：处理时间越长，融合率越高，但对细胞的毒害也越大。故一般将处理时间限制在 1.0～1.5 min 之内。若融合后不继续培养，可将处理时间延长至 20 min。

细胞融合不仅可用于核质关系、基因定位、体细胞的遗传和发育等生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，目前已成功应用于单克隆抗体的制备、新品种的培养、性状的改良、疾病的治疗和潜伏病毒的研究等领域。

① 天平

② 普通低速离心机

③ 恒温水浴锅

④ 普通光学显微镜

⑤ 滴管、5 ml 刻度离心管、盖玻片、载玻片、一次性注射器、烧杯、血细胞计数板

试剂：

① 材料：健康成年鸡

② 肝素钠

③ Alsever 溶液

④ 0.85％ 生理盐水

⑤ GKN 溶液

⑥ PEG（M，＝4000）（50％）

⑦ 詹纳斯绿（Janus green）染液

PEG 介导的鸡血细胞融合的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）Alsever 溶液

葡萄糖 2.05 g，柠檬酸钠 0.80 g，NaCl 0.42 g，溶于双蒸水中，定容至 100 ml。

（2）GKN 溶液

NaCl 8 g, KCl 0.40 g, Na2HPO4 · 12H2O 3.77 g, NaH2PO4 · 2H2O 0.78 g，葡萄糖 2 g，酚红（phenol red）0.01 g，溶于双蒸水中，定容至 1000 ml。

（3）詹纳斯绿染液

称取 30 mg 詹纳斯绿染料，溶于 100 ml 生理盐水中，混匀，即可得到 0.03％ 的染液。

（4）50％ PEG 溶液

称取 10 g PEG，151bf／in2（103.4 kPa）高压灭菌 20 min，待冷却至 50～60 ℃ 时加入 10 ml 温热的 GKN 溶液并混匀。如配制过程中 PEG 发生凝固，重新加热使其熔化。用 NaHCO3 调 pH 至 8.0。4 ℃ 保存备用，临用前置 37 ℃ 预温。最好现用现配。

（二）细胞融合

（1）将新鲜的鸡血直接注入加有一支肝素钠的烧杯中，混匀抗凝。

（2）用量筒量取一定量的上述抗凝鸡血，加入 Alsever 溶液，配制成 1：4 细胞悬液备用或 4 ℃ 冰箱保存（3～4 d 内可用）。

（3）用 1 只 5 ml 刻度离心管取 0.5～1 ml 上述鸡血悬液，加入 0.85％ 生理盐水至 5 ml，混匀平衡后，800 g 离心 5 min，弃上清液。再按上述条件重复离心 2 次。最后，弃上清液，加 GKN 溶液至 5 ml，800 g 离心 5 min。

（4）弃上清液，加适量 GKN 溶液，吸管吹打混匀，制成 10％ 细胞悬液。

（5）取以上悬液以血细胞计数器计数，若细胞密度过大，用 GKN 溶液稀释至（3～4）x107 个/ml（此步也可省略）。

（6）取以上细胞悬液 1 ml 于离心管，或在原离心管中弃去一部分悬液，保留 1 ml 于原离心管中。将离心管放入 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴锅中预热。

（7）待温度恒定后，向上述 1 ml 细胞悬液中缓慢逐滴加入 0.5 ml 预热的 50％ PEG 溶液（慢慢沿离心管壁流下融合剂），且边加边轻播离心管混匀，最后用吸管轻轻吹打混匀。放入水浴锅中静置孵育。

（8）细胞融合一段时间（10～20 min）后，加入 GKN 溶液至 5 ml，静置于水浴锅中继续孵育 20 min 左右。

（9）取出离心管，800 g 离心 5 min，使细胞完全沉降。弃上清液，加 GKN 溶液至 5 ml，重悬沉淀，重复离心 1 次。

（10）弃上清液，加入少量（0.5 ml 左右）GKN 溶液，混匀，取少量悬液于载玻片加入詹纳斯绿染液，用牙签搅匀，染色 5 min（也可用吉姆萨染液染色 5～10 min）。盖上盖玻片，观察细胞融合情况并计算融合率。

（1）滴加 50％ PEG 时，应缓慢、逐滴加入，其间最好轻弹试管底部，滴加完毕后用滴管充分温和混匀。

（2）镜检观察时要注意区分融合细胞与重叠细胞。