三种细胞免疫荧光染色操作步骤

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免疫荧光染色的主要原理是利用抗原 抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫 荧光，步骤如下：

1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS 洗3次，每次10分钟

3、4%的甲醛室温固定20-30分钟

4、1×PBS洗3次，每次10分钟

5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟

6、1×PBS洗3次，每次10分钟

7、5%BSA室温封闭30分钟

8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜

9、1×PBS洗3次，每次10分钟

10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!!

11、1×PBS洗3次，每次10分钟

12、95%甘油封片

注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释

从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光

细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：

1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

细胞免疫荧光简单实验步骤如下:

1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.

2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟

3.PBS洗净:3miundefined3

4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS

5.PBS洗净:undefined5min

6.羊血清封闭：37度，20分钟

7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度　1-2小时

8.4度　PBS洗净，3miundefined5次

9.二抗　37度小于一小时

10.37度　PBS洗净，undefined5min

凉干封片(封闭液PH8.5)

不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。