血清使用过程中应注意的问题和血清质量的决定因素

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一、关于血清使用的几点建议：

1、血清必须贮存-20℃，如存放于4℃，请勿超过两周，对于某些单位一次无法用完一瓶，可在无菌条件下将其40-45ml分装于无菌50ml离心管中(或血清瓶中)，由于血清解冻时体积会增加10%，必须预留此膨胀体积的空间，否则易发生污染或容器冻裂的情形。

2、一般公司所提供的血清一般为200ml和500ml装量，因此建议在使用中宜采取逐步解冻的方法解冻血清：-20℃→4℃冰箱或冷库溶解24小时→室温下全溶后再分装，一般以50 ml无菌离心管中分装40-45ml。使用过程中要特别注意，必须规则地将血清摇晃均匀，小心勿造成气泡，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由-20℃放置至37℃环境下解冻，因为温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而产生沉淀。

3、血清的灭活(heat-inactivation)一般是指56℃，30分钟水浴加热已完全解冻的血清，加热过程中必须规则地摇晃均匀。此处理的目的是使血清中的补体成分(complement)去活化。但是，经过灭活处理的血清会因而造成沉淀的显著增多，且会影响血清的品质。所以，有的公司所生的细胞培养 用牛血清不做灭活处理，由客户自行选择。而诊断试剂用血清在除菌过滤前进行过灭活处理。

4、在使用血清的时候，勿将血清留置于37℃太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分会因而受到破坏，影响血清的品质。

5、一般我们在使用过程中是先过滤培养基，再加血清，勿直接过滤血清。

6、血清的沉淀物：

(1)凝絮物：其产生的原因有多种，但普遍的原因是血清中的脂蛋白(lipoprotein)变形及解冻后血清中存在的纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身的品质。除非必须，如果您想减少这些沉淀物，建议可用离心3000rpm，5min去除，或离心后取上清液加入培养基中一起除菌过滤。

(2)显微镜下观察“小黑点”，通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为是血清遭受污染(如黑胶虫)，而将血清放置在37℃中欲培养此“微生物”，但37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物的增殖，但以培养细菌 的培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点不会影响细胞的生长。

二、血清质量的决定因素：

1、关于牛种：

血清质量与牛种没有必然的联系，但有其先天条件。

首先，澳大利亚、新西兰的牛源之所以被国际公认为最好，原因是这些国家的牛源是“无污染”的，“无污染”的实际含义是：病毒等外源因子污染较少。至于美国，由于其国内出现了疯牛病，其形象由此受到挑战。这种血清安全性的观念在发达国家认知度较高，而在我国还不够重视。其次，牛所能获得的营养对血清质量有影响。在我国，由于饲养条件的不同，不同地区产的血清质量是有差异的。

2、质量标准件的问题：

我国对人用生物制品生产所用的牛血清制定了国家标准，载于《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版，此标准已接近于国外胎牛血清的有关标准。内毒素：国家标准件为不高于10Eu/ml，内控标准件为不高5Eu/ml或10Eu/ml。国家标准之外的质控指标还有：免疫球蛋白 、牛腹泻病毒(BVDV)抗体、激素、和牛源安全性验证等。

3、牛血清的命名和选择：

一般公司对细胞培养用牛血清的命名分二类：胎牛血清和小牛血清。对于一般的细胞系，小牛血清可以培养得很好。

三、关于牛血清白蛋白的生产工艺：

牛血清白蛋白的制备方法有Cohn's法、盐析法、热变性法等多种工艺。不同的生产工艺其产品的名称、质量指标、应用领域等各不相同。

其中Cohn's法设备、工艺要求比较高，相对应的生产成本较高，但产品质量较好。牛血清组份V(FrationV)就是由Cohn's法制备的。一般白蛋白纯度96-99%、外观洁白、结晶性状好、1%蛋白水溶液PH7.0±0.2，再根据不同的应用分成低内毒素、低脂肪酸等等的不产品，主要应用于细胞培养领域的无血清培养基中。盐析法因生产周期长，纯度低和产品聚合体高、稳定性低等缺陷已很少应用。

目前国内应用比较普遍的是热变性法，结合较先进的超滤生产工艺，其工艺要求相对较低，制备成本低，其缺点是目前应用领域比较单一，仅供免疫诊断试剂使用。