血清使用过程中应注意的问题

一、关于血清使用的几点建议：

1、血清必须贮存-20℃，如存放于4℃，请勿超过两周，对于某些单位一次无法用完一瓶，可在无菌条件下将其40-45ml分装于无菌50ml离心管中(或血清瓶中)，由于血清解冻时体积会增加10％，必须预留此膨胀体积的空间，否则易发生污染或容器冻裂的情形。

2、一般公司所提供的血清一般为200ml和500ml装量，因此建议在使用中宜采取逐步解冻的方法解冻血清：-20℃→4℃冰箱或冷库溶解24小时→室温下全溶后再分装，一般以50 ml无菌离心管中分装40-45ml。

使用过程中要特别注意，必须规则地将血清摇晃均匀，小心勿造成气泡，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由-20℃放置至37℃环境下解冻，因为温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而产生沉淀。

3、血清的灭活(heat-inactivation)一般是指56℃，30分钟水浴加热已完全解冻的血清，加热过程中必须规则地摇晃均匀。此处理的目的是使血清中的补体成分(complement)去活化。

但是，经过灭活处理的血清会因而造成沉淀的显著增多，且会影响血清的品质。所以，有的公司所生的细胞培养用牛血清不做灭活处理，由客户自行选择。而诊断试剂用血清在除菌过滤前进行过灭活处理。

4、在使用血清的时候，勿将血清留置于37℃太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分会因而受到破坏，影响血清的品质。

5、一般我们在使用过程中是先过滤培养基，再加血清，勿直接过滤血清。

6、血清的沉淀物：

(1)凝絮物：其产生的原因有多种，但普遍的原因是血清中的脂蛋白(lipoprotein)变形及解冻后血清中存在的纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身的品质。除非必须，如果您想减少这些沉淀物，建议可用离心3000rpm，5min去除，或离心后取上清液加入培养基中一起除菌过滤。

(2)显微镜下观察“小黑点”，通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著增多。

有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为是血清遭受污染(如黑胶虫)，而将血清放置在37℃中欲培养此“微生物”，但37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物的增殖，但以培养细菌的培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点不会影响细胞的生长。

二、血清质量的决定因素：

1、关于牛种：

血清质量与牛种没有必然的联系，但有其先天条件。

首先，澳大利亚、新西兰的牛源之所以被国际公认为最好，原因是这些国家的牛源是“无污染”的，“无污染”的实际含义是：病毒等外源因子污染较少。

至于美国，由于其国内出现了疯牛病，其形象由此受到挑战。这种血清安全性的观念在发达国家认知度较高，而在我国还不够重视。其次，牛所能获得的营养对血清质量有影响。在我国，由于饲养条件的不同，不同地区产的血清质量是有差异的。

2、质量标准件的问题：

我国对人用生物制品生产所用的牛血清制定了国家标准，载于《中国生物制品主要原辅材料质控标准》2000年版，此标准已接近于国外胎牛血清的有关标准。内毒素：国家标准件为不高于10Eu/ml，内控标准件为不高5Eu/ml或10Eu/ml。国家标准之外的质控指标还有：免疫球蛋白、牛腹泻病毒(BVDV)抗体、激素、和牛源安全性验证等。

3、牛血清的命名和选择：

一般公司对细胞培养用牛血清的命名分二类：胎牛血清和小牛血清。对于一般的细胞系，小牛血清可以培养得很好。

三、关于牛血清白蛋白的生产工艺：

牛血清白蛋白的制备方法有Cohn's法、盐析法、热变性法等多种工艺。不同的生产工艺其产品的名称、质量指标、应用领域等各不相同。

其中Cohn's法设备、工艺要求比较高，相对应的生产成本较高，但产品质量较好。

牛血清组份V(FrationV)就是由Cohn's法制备的。一般白蛋白纯度96-99%、外观洁白、结晶性状好、1%蛋白水溶液PH7.0±0.2，再根据不同的应用分成低内毒素、低脂肪酸等等的不产品，主要应用于细胞培养领域的无血清培养基中。盐析法因生产周期长，纯度低和产品聚合体高、稳定性低等缺陷已很少应用。

目前国内应用比较普遍的是热变性法，结合较先进的超滤生产工艺，其工艺要求相对较低，制备成本低，其缺点是目前应用领域比较单一，仅供免疫诊断试剂使用。

问答、讨论和经验：

1、问：一、5中：“一般我们在使用过程中是先过滤培养基，再加血清，勿直接过滤血清。”

(1)是过滤培养基(1640)，再加血清，然后再过滤还是加入血清后就不用过滤了啊？(2)配的冻存液(1640，小牛血清20%，DMSO10%)，放在-4℃保存好还是-20℃保存好呢？(3)我最近要冻一批细胞，每次配的话很麻烦，先配好然后直接用，不知道这样是否可行？

答：(1)我们是过滤培养基，再加灭活的血清。然后就不用过滤了.

(2)你冻存液的配方是最老的，7:2:1吧。一般可以这样配。如果细胞珍贵的话，可以按血清：DMSO，9:1配冻存液。

(3)冻存液最好现配现用！

2、问：一、5中：“一般我们在使用过程中是先过滤培养基，再加血清，勿直接过滤血清。”

请问：(1)直接过滤血清有什么弊端？(2)你用的是进口的血清吧？我们实验室用的国产血清，不过滤对细胞有影响，可能是因为血清中的有害物质。

暂无回答。

3、问：(1)一、6、(2)中：“显微镜下观察‘小黑点’，通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著增多……一般而言，此小黑点不会影响细胞的生长。”并没有指出小黑点是什么。请问，那些小黑点到底是什么？为什么会出现？是购买血清时就有的(即血清生产过程中就出现)，还是购买后存放实验室的保存原因？

(2)前面讨论2中所说，“往往在培养过程中死细胞，脱落细胞比较多；或者血清的原因等，也会导致细胞脱落死亡，培养液浑浊，可能就被误认为是污染了。”我在细胞培养过程中也遇到了类似的问题，我也认为是被污染了，我的处理是直接把培养物全部丢弃掉。请问这些是什么原因？为什么会出现？

暂无回答。

4、问：我冻存的是儿童白血病初诊断时骨髓提取的单个核细胞，老板让先冻着，也没想好做什么,有好的建议吗？

暂无回答。

5、讨论：一、6、(2)中：“显微镜下观察‘小黑点’，通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著增多……一般而言，此小黑点不会影响细胞的生长。”

养细胞的过程中，遇到问题的时候还是要从最基本的问题考虑起。还有就是有的细胞本身特性，生长繁殖快，不宜贴壁，比如一些高转移的肿瘤细胞，往往在培养过程中死细胞，脱落细胞比较多；或者血清的原因等，也会导致细胞脱落死亡，培养液浑浊，可能就被误认为是污染了。

6、讨论：(1)一、2中“一般公司所提供的血清一般为200ml和500ml装量，因此建议在使用中宜采取逐步解冻的方法解冻血清：-20℃→4℃冰箱或冷库溶解24小时→室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管中分装40-45ml。使用过程中要特别注意，必须规则地将血清摇晃均匀，小心勿造成气泡，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由-20℃放置至37℃环境下解冻，因为温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而产生沉淀。”

关于这一点我不认同,应该是直接由-20℃放置至37℃水浴解冻,我没有看你提供的链接。不知你来源是否权威。我们都是用水浴，很好。而且你可能不作临床不知道临床是如何应用的，在输血科，冰冻血浆就是水浴解冻的。当然两者不同，但是血浆成份更复杂。为了最好的保存活性物质，要用最快的速度解冻。欢迎讨论。

(2)：我也是直接在37度溶解的。不知道到底那种方法是正确的，或者说是合理的。我用的血清是便宜的那种，好的与差点是不是采用的方法不一样？

(3)：个人认为，细胞培养血清和医用血清(医用血浆)使用目的不一样，还有可能是血清和血浆的最大区别是，血清不含纤维蛋白原，所以在解冻方法上有所不同！医务工作者都知道，医用血浆使用目的是扩容，在患者手术失血或创伤失血情况下，增加患者机体的供血量，起到扩容作用。而细胞培养用的血清，我们推荐用：-20℃，2-8℃，37℃(尽量少的时间)，这样的过程，还主要是防止血清沉淀物的形成，包括一些对细胞培养有做用的多肽因子，如果从－20℃直接到37℃，那么这些多肽因子可能会发生结构变化，而导致功能失活。所以一般的细胞培养还是推荐用梯度法，－20℃，2-8℃，37℃这样的步骤！以上均是个人理解，请大家发表自己的看法！

7、经验：一个简单方法判断是否有污染，那就是打开培养瓶盖闻一闻，如果有异味，那就绝对污染了。