Southern blot实验安排总结
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<center> <img alt="Southern blot实验安排总结" height="262" src="http://ts1.cn.mm.bing.net/th?id=H.4758919165511564&pid=1.7" width="392" /></center> Southern blot 实验安排
酶切及转膜:
第一天晚上:
酶切过夜
第二天:
跑电泳,看酶切效果。50V,6小时。转移过夜。
同时准备吸水纸、Watmamm 3mm的滤纸、尼龙膜、磁盘、玻璃板、
剪刀、钝头镊子、铅笔、小的饭盒
配置试剂:
20×SSC:
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
溶于800ml水中,调PH值至7.0,定容至1L,灭菌。
20%SDS
在400ml中加入100gSDS,定容至500ml。
变性液缓冲液
0.4mol/L NaOH
将12.8g NaOH溶于水中,定容至800ml。
2×SSC
将10ml20×SSC溶于水中,定容至100ml。
0.5×SSC/0.5%SDS
2.5ml 20×SSC和2.5mlSDS溶于水中,定容至100ml。
1M phosphate Buffer PH6.8
1M Na2PO4(FW 142) 1M NaH2PO4(FW120)
称:0.1L×1M×142=14.2g 0.15L×1M×120=18g
溶于水中,定容至100ml。 溶于水中,定容至150ml。
最后按Na2PO4:NaH2PO4=46.3:53.7=92.6ml:107.4ml 配200ml
第三天:
将尼龙膜用2×SSC 将但润洗,再用煮沸的0.5×SSC/0.5%SDS漂洗两次至溴酚蓝颜色消失。置于湿润的滤纸上,结合有DNA的一面向上,微波炉内烘烤至滤纸与膜自然分离(约2分钟)。膜用保鲜膜包裹后存在4度待用。
杂交过程实验安排:
前一天领钥匙,登记。
第一天:
预杂交及杂交液:
(注:BSA 要求新鲜配置,要先溶解后混合,不然很难溶解)
配50ml
1%BSA 0.5g(先加5mlddH2O溶解)
7%SDS 20%SDS17.5ml
0.5M Phosphate buffer 1M:25ml
1mM EDTA 0.5M:100µl
鲑鱼精DNA 100µg/µl 10mg/ml:50µl
ddH2O溶解至45ml,与5ml 1%BSA混合,定容至50ml水中。
洗膜液I(磷酸系统) 100ml
BSA 0.5% 0.5g
EDTA 1mM 0.5M:200µl
NaHPO4(PH7.2) 40mM 1M:4ml
SDS 5% 20%:25ml
洗膜液II(磷酸系统) 100ml
EDTA 1mM 0.5M:200µl
NaHPO4(PH7.2) 40mM 1M:4ml
SDS 5% 20%:25ml
杂交:门卡、卫生纸、滤膜(预先剪好)、钥匙、同位素探测仪、报纸、剪刀、10小条封口膜、计时器、冰盒+冰、袖筒、垃圾袋、镊子(已有)、手套、多个浮板
洗膜:X光片夹、保鲜膜
注意:封口膜一定要先撕好了。
浮板尺寸要合适。
1、预杂交:
取膜,结合有DNA的一面朝下,放于预热的预杂交液中,65度4个小时。
2、探针标记:
(1) 在0.5ml离心管中加入下列试剂,95℃加热3分钟,迅速置于冰中,放置5分钟。
探针 8μl
Random Primer 2μl
dH2O 4μl
(2)加入10×Buffer,dNTPMixture 2.5μl,用于标记的dCTP 5μl。
(3)加入1μl Exo-free Klenow Fragment,37℃反应10分钟。
(4)65℃加热5分钟使酶失活。
(5)95℃加热3分钟迅速置于冰中冷却。
(6)取适量的反应液直接作为探针使用。
3、杂交
将标记好且已经变性的探针加入杂交液中,65度杂交14~16小时,间或摇动一下。
4、洗膜:
杂交完后,分别用洗膜液I室温下洗20分钟,洗膜液II室温下和65度各洗20分钟。洗完后稍微干燥晾干杂交膜(不可完全干燥),用保鲜膜包裹后通过放射性探测器测量杂交信号的强弱,放于X光片夹中。
5、压片,洗片:
压片1~2天,先显后定。
蛋白SDS-PAGE电泳
原理:蛋白被变性和失去电荷后其迁移率只与蛋白分子量大小有关。
电泳仪:宁波新芝科器研究所MV-II型双垂直拟电泳槽
试剂配制:
清洗玻璃板:先用蒸馏水冲洗,再用脱脂棉醮无水乙醇擦拭玻璃表面,晾干。
配置10%过硫酸铵溶液(APS):称取0.1g过硫酸铵(Ammonium Persulfate),加水至1ml。
事先配好的各项母液:10%(w/v)SDS 溶液:称取10克SDS,溶于100 ml蒸馏水,微热使溶解。
1%(v/v)TEMED溶液:取1 ml的TEMED(即N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺),稀 释至100ml。储存于深色瓶内,4℃保存。
10%过硫酸铵:(NH4)2S2O8(简称AP)1克溶于10 ml水,用前配制。
蛋白质样品处理液:(不连续系统)
a. 先配制0.5 M pH 8.0 的Tris-HCl buffer:0.61g Tris溶于50 mlddH2O,用1M 盐酸调pH。
b. 10% SDS溶液2 ml,
β-巯基乙醇 0.5 ml,
Sucrose 4 g,(or 甘油1 ml)
溴酚蓝 2 mg,
0.05M Tris-HCl buffer, 加水至总体积 10 ml (1×)
电极缓冲液:含0.1% SDS的0.05 M Tris-0.384 M Gly buffer, pH 8.3
6.0 g Tris
28.8 g Gly
10% SDS 10 ml , 加水稀释到1升
凝胶缓冲液:
a. 浓缩胶缓冲液:
0.5 M,pH 6.8 Tris-HCl buffer:
称取6.0 g Tris,加入50 ml 水溶解,用1M盐酸调pH,定容至100 ml。
b. 分离胶缓冲液:
1.5 M,pH8.8 Tris-HCl buffer:
称取18.2 gTris,用少量水溶解,加入盐酸25 ml,再用盐酸调pH,加水定容100 ml。
凝胶储备液:
a. 浓缩胶储备液:
10%丙烯酰胺- 0.5%甲叉双丙烯酰胺溶液:
10gAcr, 0.5g Bis, 溶于100ml水,滤去不溶物,储存于深色瓶中。
b. 分离胶储备液:
30%Acr–0.8%Bis溶液:
30g Acr , 0.8 g Bis, 溶于100ml水,过滤,储于深色瓶内。
分离胶的配制:按下述配方配制15ml,灌注9ml为佳。
SDS-PAGE 不连续垂直平板电泳:
试剂: 蛋白质标准Marker
10% (w/v)SDS 溶液
1% (v/v)TEMED溶液
10% 过硫酸铵
蛋白质样品处理液
电极缓冲液
凝胶缓冲液
凝胶储备液
SDS-不连续系统分离胶和浓缩胶的配制:
试剂名称 |
配制30 ml 不同浓度的分离胶所需的试剂量(ml) | 配制10ml5%浓缩胶所需试剂(ml) | ||||
7%分离胶 | 10%分离胶 | 12%分离胶 | 15%分离胶 | 20%分离胶 | ||
分离胶储备液 | 7 | 10 | 12 | 15 | 20 | |
分离胶缓冲液 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | |
浓缩胶储备液 | 5 | |||||
浓缩胶缓冲液 | 2.5 | |||||
10%SDS溶液 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.1 |
1%TEMED | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0.8 |
蒸馏水 | 13 | 10 | 8 | 5 | 1.5 | |
10%过硫酸铵 | 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 |
2. 浓缩胶的配制:按上述配方配制5ml,灌注2~3ml即可。
3. 电极缓冲液的配制:(5X,200ml)28.8g 甘氨酸,6.04g Tris, 10ml 10%SDS,pH应在8~9之间。
4. 染色液的配制:0.25%考马斯亮蓝R-250(COOMASSIE R250),50%甲醇,7%乙酸水溶液。
5. 上样缓冲液:上样缓冲液也可用以下配方:浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS1.6ml、2-ME0.4ml、0.025%(W/V)溴酚蓝0.2ml、水4.0ml或浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml、2-ME0.4ml、0.025%(W/V)溴酚蓝0.2ml、水2.4ml。临用前加入2% 2-巯基乙醇(2-ME, 2-Mercaptoethanol),Protein样品与上样缓冲液1:1混匀后100℃加热3~5分钟,降至室温后高速离心3分钟,取上清加样。每孔点样量以30ul为宜。
6. 电泳:1X电极缓冲液约400ml,电压100V,电流处在20~40mA之间,约3~4小时后电泳完毕。
7. 将玻璃板撬开后染色2~3小时,回收染色液。
8. 过夜脱色或脱色3~4小时,脱色液配方:7%乙酸,30%甲醇的水溶液。
9. 拍照处理或凝胶成象,记录结果。
10. 干胶:脱色后的凝胶用30%甲醇、7%乙酸、2~5%甘油的水溶液振荡处理1小时,取两张在水中浸泡过1分钟的醋酸纤维膜平铺于干胶器上,凝胶处于两膜之间,用玻璃棒滚动除去气泡,压上干胶框,四周夹上夹子,风干或干燥箱干燥24小时以上。
细胞核大片段DNA的提取方法
准备
1. 灭菌:3个500 ml烧杯,研钵,小钥匙,5 ml离心管,10 ml 离心管,5 ml枪头, 剪口1 ml 枪头;
2. 酒精处理:100 ml离心管,小铁铲,模具;
3. 清洗尼龙膜:洗干净SDS,小烧杯,玻璃棒;
4. 核分离缓冲液(NIB),裂解Buffer,TE预冷;
5. 液氮, 10g 以上材料, 冰。
具体操作:
1. 在液氮中将材料研磨成粉末,尽量磨碎;
2. 在烧杯中加入核分离Buffer,预冷,按10ml/g加入;
3. 将粉末加入烧杯中,用玻璃棒轻轻搅匀,分散成块的粉末,冰上静置10 min;
4. 将混合物在单层大孔径尼龙膜上过滤:在液体滤过以后,带手套将尼龙膜卷起轻轻挤压,挤出残留液体;
5. 液体在双层尼龙膜上再过滤一次;
6. 加入1/20体积的核分离Buffer(含10% Triton),轻轻搅匀,静置10 min:时间不能延长,Triton的量不能增加,否则易使核破裂;
7. 4000 rpm离心10 min,小心倒尽上清:上清中可能还带有白色颗粒状的悬浮物,这是Triton与蛋白的结合物;
8. 加入50 ml核分离Buffer,重新悬浮沉淀,4000 rpm离心10 min;
9. 加入50 ml NIB,悬浮沉淀, 4000 rpm 离心10 min;
10. 配制1-1.2%低熔点琼脂糖(LMT agarose)
11. 尽量除去上清,将混合物置于42℃中平衡,在沉淀混合物中加入等体积的LMT agarose(65℃) 小心用剪口1 ml枪头混匀,将混合物注入模具中(模具预冷),要快,否则会凝固于管中;
12. 配制裂解Buffer
13. 将包埋成块推出,浸入裂解Buffer,置于50℃,24h后更换裂解Buffer,再置于50℃处理24h;
14.
100 ml:
1.TE(PH8.0)在冰上洗涤三次,每次20min; 2.含1 mM PMSF的50 ml TE(PH8.0)冰上洗涤1h 3.5 ml TE(PH8.0)存放于4℃ 3 |
1. 所有用具,器皿,溶液都要预冷;
2. 全部操作都要在冰上进行,除包埋块的浇注和核破裂的过程
3. 动作一定要轻柔而快速。
核分离Buffer
终浓度 | 母液 | 100 ml 所用量 | |
Tris—HCl(PH9.5) | 10 mM | 1M | 1 ml |
EDTA | 10 mM | 0.5M | 2ml |
KCl | 100 mM | 1M | 10ul |
Sucrose | 0.5M | 17.11g | |
Spermidine 亚精胺 | 4mM | 0.2M | 2ml |
Spermine 精胺 | 1.0mM | 0.1M | 1ml |
Mercapto-ethanol 巯基乙醇 | 100ul | ||
Triton X-100 | 10ml |
终浓度 | 母液 | 10ml | |
Sarkosyl十二烷基肌氨酸钠 | 1% | 20% | 0.5ml |
EDTA(PH 8.0) | 0.25M | 0.5M | 5ml |
Proteinase K | 0.2mg/ml | 2mg |
【配制方法】
用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml(10mmol/L),分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液(100mmol/L)。
【注意】
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快,且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时,20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min,这表明将PMSF溶液调节为碱性(pH>8.6)并在室温放置数小时后,可安全地予以丢弃。