凝胶迁移或电泳迁移率实验技术进展

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凝胶迁移或电泳迁移率实验原理

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

具体实验操作中，我们通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳 上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异)， 和其它非相关的片段(非特异)，来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

对于基因表达 调控，必须从三个层次展开：一是分离和鉴定基因5’端核心启动子等顺式作用元件，二是分离和鉴定与各顺式作用元件相对应的转录因子，三是检测各顺式作用元件与对应转录因子的相互作用。鉴定顺式调控元件和转录因子是研究得比较多的内容，而对于顺式作用元件与对应转录因子的相互作用这个层次的研究相对较为薄弱。电泳迁移率检测(electrophoretic mobility shift assay)是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，它正是对第三个层次进行研究的技术之一，核心功能是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列的结合蛋白分子。

众所周知，结构基因组 学已经很容易实现高通量分析，但在功能研究这个层次上，目前还没有真正高通量的分析技术出现。和其他功能研究技术一样，电泳迁移率检测(electrophoretic mobility shift assay)本身也存在诸多缺点，比如对于低亲和力结合很难进行鉴定;难以比较不同片断之间亲和力大小的差异;对于蛋白复合体与DNA的结合也无法鉴定。由于体外环境和体内环境存在巨大的差异，电泳迁移率检测(electrophoretic mobility shift assay)很难真正重建体内蛋白质与DNA之间结合过程，对EMSA进行改良或发展更好的研究蛋白质与DNA互作的技术很有必要。