脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察

【摘要】 ［目的］采用化学脱 细胞 方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外 基质 支架,为桥接 脊髓 损伤缺损提供理想的天然神经支架.［方法］取SD大鼠胸段脊髓约2 cm,运用冻融+化学萃取（3%脱氧胆酸钠和1 KU/ml DNaseI、RNaseA）的 组织工程 学方法处理大鼠脊髓组织,并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查,了解脱细胞情况及 细胞外基质 支架形态.［结果］经过脱细胞处理后,光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路；未见 轴突 、髓鞘和细胞核.髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底,未见髓鞘成分.［结论］本实验采用冻融+化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为 脊髓损伤 后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1 KU/ml DNaseI、 RNase A进行脱细胞处理两次是较为合适的,能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结 构.
【关键词】 脱细胞脊髓 组织工程支架 大鼠
　　Preparation of acellular scaffold of natural spinal cord and observation of morphology∥GUO Shu?zhang,REN Xian?jun,JIANG Tao,et al.　　Department of Orthopaedics,Xinqiao Hospital of Third Military Medical University,Chongqing 400037,China
　　 Abstract： ［Objective］Using a procedure of chemical agent to remove the cells and myethin in spinal cord of rat and to prepare the scaffold of extracellular matrix,so as to obtain an ideal natural spinal cord scaffold to bridge the nerve gap.［Method］Rat spinal cord was cut and treated using the method of freeze thawing and chemical extraction（3%sodiumdeoxycholate and 1KU/ml DNaseI,RNaseA）.Histology was exploited to evaluate the degree of acellular and the structure of the spinal cord scaffold.［Result］In cross section,network of the extracellular matrix was presented in the scaffold.The cells, myethin and axons disappeared after the spinal cord was treated with sodium deoxycholate and DNaseI,RNaseA.Typical network of empty tubes were viewed in longitudinal sections.［Conclusion］An ideal spinal cord scaffold can be produced with the method designed in author?s experiment.This scaffold has similar three dimensional structure with normal spinal cord,which can be used as a graft to bridge the nerve gap directly or as a scaffold to implant the seeding cells in spinal cord tissue engineering.The experiment indicates that cells and myethin can be removed and the three dimensional structure be reserved by chemical extraction with 3% sodium deoxycholate and 1KU/ml DNaseI,RNaseA.Chemical extraction is an ideal method to prepare tissue engineer scaffold of spinal cord.
 　 Key words： acellular spinal cord；  tissue engineering scaffold；  rat
　　近年来,以组织工程技术修复脊髓损伤是研究的一个新热点.在构建组织工程化脊髓的过程中包括两个最基本的问题,即组织工程支架和种子细胞.其中支架材料及三维结构对治疗效果具有至关重要的作用.目前应用的组织工程支架材料在物理性能、生物性能及其形态结构与正常的在体脊髓相比,都有较大的差距,尚无与脊髓三维结构高度相似且在理化性能也与脊髓相似的支架材料,因此本研究试图探索运用冻融+化学萃取的组织工程学方法制备脱细胞的天然脊髓支架,从而为脊髓损伤修复提供理想的支架材料.
　 1  材料与方法
　　 1.1  材料与仪器
　　SD大鼠（第三军医大学大坪医院实验动物中心）,脱氧胆酸钠(北京奥博星公司),DNase I、RNase A(华美 生物工程 公司),恒温回旋振荡器(重庆仪器有限公司),铁明矾、硼砂及铁氰化钾为新桥医院病理科惠赠.
　 1.2  大鼠脱细胞脊髓支架的制备
　　以戊巴比妥钠将SD大鼠经腹腔麻醉,背部去毛后消毒,取后正中切口,打开椎板,显露脊髓,取胸段脊髓约2 cm.PBS缓冲液清洗,去除表面血迹,参照Ribatti等〔1〕方法并加以改进：(1)脊髓置于-80 ℃深低温冰箱中冻存1 h,室温下解冻；(2)将脊髓组织置于蒸馏水内,在室温下浸泡6 h,每2 h换液1次；(3)置于3%的脱氧胆酸钠盐蒸馏水溶液（加入适量1 mol/L NaOH至溶液pH值为8～9）连续震荡4 h（恒温回旋振荡器内持续振荡,25 ℃ 100 转/分）；(4)蒸馏水中振荡浸泡3 h,1 h换液1次；(5)置于1 KU/ml DNase和RNase混合液中持续振荡30 min；(6)蒸馏水浸泡3 h,1 h换液1次;(7)重复(3)～(6)再萃取1遍,最后将萃取后的脊髓组织置于冷冻干燥机中冻干,60Co照射消毒,照射剂量2.5 Gy,消毒后-80 ℃冰箱保存.
　　 1.3  组织学观察
　　1.3.1  HE染色
　　将化学萃取的脊髓支架和大鼠正常脊髓用10%中性甲醛缓冲液固定,常规石蜡包埋,两种标本均行横切片和纵切片,切片后进行HE染色,光镜观察.
　　1.3.2  髓鞘染色(Weil髓鞘染色法)
　　组织切片厚5～8 μm,脱蜡至水,Weil苏木精50 ℃,15 min（10%纯酒精性苏木精5 ml,4%铁明矾50 ml,蒸馏水45 ml）,自来水洗15 min,4%铁明矾分化至灰白质分辨明显,必要时用Weigert分化液补充分化（硼砂2 g,铁氰化钾2.5 g,蒸馏水200 ml）,自来水洗,脱水,透明,封片,光镜观察.
2  结果
　　 2.1  肉眼观察
　　在脱细胞、蒸馏水浸泡过程中可见大量白色絮状物自脊髓内析出,脱细胞处理的脊髓支架颜色呈乳白色,半透明状,仍维持圆柱形,粗细为处理前的2/3～4/5,略变短.强度略有下降,韧性与处理前脊髓组织相似,黏性略有增加.
　 2.2  HE染色
　　正常大鼠脊髓横切面结构,含有大量 神经元 和胶质细胞,组织结构致密,髓鞘存在.脱细胞处理所获得的脊髓支架横切面上呈大小不等的网眼状结构(图1),轴突及髓鞘均已消失,未见细胞成分存在.纵切面可见脊髓支架呈交错的纵行管状结构(图2).
2.3  髓鞘染色
　　正常脊髓切面上可见髓鞘染色呈黑色,无明显破坏,形态规则,厚度正常（图3）,脱细胞脊髓未见髓鞘成分或存在极少量髓鞘碎片.
　  大鼠脱细胞脊髓横切面,细胞脱除彻底,组织呈网状结构  （HE×200）（略）
　　大鼠脱细胞脊髓纵切面,未见细胞成分,组织结构呈交错纵管状  （HE×200）（略）
　　正常大鼠脊髓Weil染色,髓鞘结构正常,形态规则  （×400）（略）
　　大鼠脱细胞脊髓Weil染色,髓鞘结构消失,无细胞成分存在  （×400）（略）