2．幽门螺杆菌的基础实验研究--大鼠实验性幽门螺杆菌感染

 

2．幽门螺杆菌的基础实验研究

大鼠实验性幽门螺杆菌感染

研究表明，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）与胃炎、消化性溃疡等胃部疾患密切相关，为此，我们对某些实验性动物进行实验，结果发现Wistar大鼠经口感染Hp，可导致实验性感染。从其胃组织中检查到并分离出Hp，粘膜组织亦显示某些病理变化。从而为研究Hp实验性感染提供较为合适的一种动物模型。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽门螺杆菌Hp379及Hp404株，系北京市积水潭医院消化内科就诊的胃病患者，经由内窥镜取得的胃粘膜进行细菌培养分离到的。经过鉴定，由本室传代保存。

1.2 动物 Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所。新西兰种家兔，C57和BALB/小鼠，由本所动物室供给。

1.3 感染方法 Wistar大鼠的实验分2次进行。第1次用出生5个月（体重175g～254g）的成年鼠，第2次用出生两个月（体重152g～174g）的幼龄鼠。动物先禁食12h～14h，用胃管喂以5%Na2HCO32ml,15min后用胃管注入Hp379或Hp404株的菌液1.5ml(1010CFU/ml,30min后给食。每周感染1次，共4次。对照组动物不感染Hp，饲养条件与实验组相同。用以感染的家兔为幼龄兔（体重1200g～1500g）。C57小鼠为4周龄幼鼠（10g～12g），BABL/C用成年鼠（18g～20g）。感染方法同大鼠，家兔每次感染量为2ml，小鼠为0.5ml(1010CFU/ ml)，每周感染1次，共5次。动物在最后1次感染后的第7d～10d，禁食12h～14h后，乙醚麻醉处死，无菌操作取出胃，用灭菌PBS洗去胃内容物，从靠近幽门端的不同部位剪取胃粘膜3～4小块，加含10%小牛血清的布氏肉汤2ml，用组织研磨器制成浆，用以做尿素酶试验，直接涂片检菌和细菌培养。其余的胃组织用10%甲醛（PBS配制）固定，供病理学检查。

1.4　 细菌学检查　①尿素酶试验基本参考Morris等的方法。②胃粘膜直接涂片检菌法：取粘膜匀浆滴推成涂片，用甲醇固定10min，0.3%碱性复红染色，镜检Hp菌。③Hp菌培养：以布氏琼脂为基础，加入6%脱纤维羊血及脱氧胸苷酸（TMP）5mg/L，万古霉素6mg/L，两性霉素2mg/L，制成血平板后，置4°C保存备用。取胃粘膜匀浆0.2ml于血平板后，涂匀后放入含10%CO2、5%O2及85%N2的混合气体培养箱中，57°C培养72h后观察结果。

1.5 病理学检查 　甲醛固定的胃组织,石蜡包埋，切成6μm厚的组织切片。分别用苏木素-伊红和Warthin-Starry镀银染色，观察病理改变和检查组织切片中的Hp。

2 结果

2.1　尿素酶试验　经口感染Hp的8只大鼠，其胃粘膜做尿素酶试验，多数在4h内，个别的24h出现阳性反应。对照组大鼠的胃粘膜呈阴性反应。经哭喊Hp的家兔、C57和BALA/C小鼠的胃粘膜，均呈阴性反应。

2.2 　涂片细菌检查　 感染Hp的8只大鼠的胃粘膜匀浆，制成涂片染色后镜检，均检查到Hp。未感染的大鼠胃粘膜涂片未找到Hp。感染Hp的兔、C57和BALB/C小鼠的胃粘膜涂片亦未检查到Hp。

2.3 细菌培养 各组动物的胃粘膜组织都做了Hp培养，结果只有感染Hp的大鼠胃组织，分离出Hp。其他各组均款培养出Hp。

2.4 组织切片细菌检查 胃粘膜组织切片用Warthin-Starry染色，背景为淡黄色，Hp染色成黑色。感染Hp的大鼠，无论是幼龄鼠或是成年鼠，其胃粘膜切片中均可找到Hp，它们主要分布于粘液层。粘膜上皮细胞的表面和粘膜的隐窝处。切片中的Hp形成呈半圆、S或螺旋状，未感染Hp的正常大鼠，胃组织中未找到Hp。感染Hp 的家兔、C57和BALB/C小鼠的胃切片中，亦未检到Hp。

　　2.5 病理组织学检查 感染Hp大鼠的胃组织切片中，可见粘膜上皮细胞变 性病 灶，细胞肿胀而变得不规则，胞浆内结构不清或消失。粘膜层见有单个核细胞浸润病灶。

3 讨论

上述结果表明Wistar大鼠对Hp易感。经口感染Hp，可从其胃粘膜中检查到并分离出Hp，胃粘膜亦出现病变。与之相反，家兔、C57和BALB/C小鼠，示能引起Hp的实验性感染。Ehler曾用Lewis大鼠，C57BL/6和BALB/C小鼠做实验，试图建立Hp的动物模型，未获成功。他们的小鼠实验结果与我们的结果相同，都是阴性。但大鼠的实验结果不同。可能是因为实验条件不同的缘故。

自从1983年首先从人胃中分离到Hp以后，相继从水貂和恒河猴的胃组织中分离出Hp样细菌。那么，我们从感染的Wistar大鼠胃组织中分离到的Hp是否亦是自然存在的呢？看来，这种可能性不大。因为，如前所述，未感染的对照组大鼠，用各种方法检测，都没有检查到Hp菌

最近报道悉生仔猪经口感染Hp，可从胃组织中分离出Hp。但用悉生仔猪做实验，不但费用昂贵，而且不方便。根据本实验结果，我们认为Wistar大鼠，尤其是幼龄鼠，是研究Hp菌较为理想的动物模型。但是，多次感染是必要的。

陈晶晶 姚楚铮 庄� 卢文红

中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所（北京 102206）