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    构建和表达以寡核苷酸为基础的反义盒

    相关实验：在哺乳动物细胞中表达和鉴定核酶及短发夹 RNA 实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    构建和表达以寡核苷酸为基础的反义盒

    材料

    试剂
    贴壁生长的哺乳动物（最好是人类）细 胞 系 （如 H E K 293和 H C T 116) 含 有 L B 培养基和青霉素（50fxg/m l ) 的琼脂平板 将 15g Batco琼 脂 溶 解 在 I L 的 L B 培 养 基 中 ，高 压 灭 菌 。冷 却 至 50°C 后 ，加 人 〇.5ml 100mg/m l的青霉素。 . A T P (G E H ealthcare Life Science) 牛 小 肠 碱 性 磷 酸 酶 （ N ew E ngland B ioLab) 小量柱纯化试剂盒 完全细胞培养基和基础细胞培养基 IOXDNA 连 接 酶 缓 冲 液 （500mmol/L p H 为 7. 5 的 Tris-HCl、 lOOmmol/L . MgCl2、 100mmol/L DTT、 10mmol/L A TP，并可选择性加入牛血清白蛋白 至终浓度为25(Vg/ml) 双萤光素酶报道检测系统（Promega E 1910或 E 19600) 表达载体 pcD N A 3-U 6M ， pF R T -U 6M ， p F R T U 6t e t ， p F R T -H lte t (以 上 由 作 者 提 供 ） pcD N A 3. I (Invitrogen) pcD N A 5/F R T /T 0 (In vitrogen ) psiC heck (P rom ega C8021) 胶纯化试剂盒 感受态细菌（如 D H 5a 和 D H 10B ) Lipofectam ine 2000 (Invitrogen ) L B 培养基 称 1(^胰 蛋 白 胨 、 5§ 酵 母 提 取 物 及 10§ 1^(：1，溶入9001111去离子水中。用5111〇1/乙的 NaOH将 p H 调 至 7 . 0 , 将 体 积 加 至 1000ml，高压灭菌。 1 X N E B 2 缓 冲 液 （ 50m m o l/L N aC l， 10m m o l/L p H 7.9 的 丁 ris-H C l, lm m o l/L D T T ， lO m m ol/L M g C L ， 50m m o l/L D T T ) 多 核 苷 酸 激 酶 （ N ew E ngland B ioL abs) 限制性内切核酸酶 B g H l 、 K p n l 、 X h o l 、 N o t l 、 B a m H l 测序引物 U 6-F o r S7CcaaggtcgggcaggaagS^ (T m= 60. 9°C ) B G H -R ev 5 /aggggcaaacaacagatggc3 / (T m= 62.1°C ) R L uc-F or 5 ^gaggacgctccagatgaaatgS ^ (T m= 59. 5°C ) T K -R ev S^ g a g a g tg tttcgttccttccc3 7 (T m= 60. 8°C ) T 4 D N A 连 接 酶 （ N ew E ngland B ioLabs)
    目的特异的寡核苷酸 寡核苷酸应以最低的范围合成并只通过脱盐纯化。溶解在lOnmol/L pH7. 5 的 T ris缓冲液 中，通过紫外分光光度计检测浓度，调整浓度至l ( % m〇 l/L 作为储存液。 lm o l/ L T r is 缓 冲 液 （p H 7.5) 称 量 6. 05g T r i s ,溶 解 在 30ml去离子水中，用 5m ol/L的 H C l调 节 p H , 最后用水定容 至 50ml0 仪器 细菌培养皿 摇床 荧光/化学发光检测仪 组织培养皿（I O O m m ) 或 烧 瓶 （T -75) 组织培养板（24孔） 方 法 寡核苷酸盒的制备 1.为每一个寡核苷酸准备一个单独的20M1 lOfxmol/L 的磷酸化反应: lOO^mol/L 寡核苷酸储存液 2今 I 10X P N K 缓冲液 2. OjLil 10m m o l / L A T P 2. Om I P N K 5.0/xl H 2O 13. 5/jlI 37°C 孵育 l h。 2.将每个互补的磷酸化寡核苷酸各IOm I 混合。 75°C 孵 育 I O m i n 使酶失活并通过接下来 的缓慢降温复性（逐渐降温至30〜40°〇。 最终的寡核苷酸双链的浓度是Sfxmol/L 。 3•稀释25倍 ，终浓度为200n m o l / L (对于70b p 的寡核苷酸盒来说约为9n g /fxl)。 载体的制备 4 在 50jl J 1XNEB2 缓冲液中，用 30〜40U B g m 和 消 化 3 ~ 4 Mg 适当的载体 (pcDNA3-U6M、 pFRT-U6M、 pFRTU6tet、 pFRT-H ltet)， 37°C孵育 2〜4h。 5•加人W 牛小肠碱性憐酸酶（l O U /pl)，再孵育l h 。 一旦上一步的某一种酶的消化不完全，去磷酸化可以减少背景。 6•用1 . 0 % 的琼脂糖凝胶电泳分离消化的片段。用干净的手术刀切割线性化的载体片 段 。留下1〜2fxl酶切反应体系作为步骤8 的对照组。 7•用胶纯化试剂盒纯化线性载体，将纯化的D N A 溶解在30〜40^1试剂盒提供的缓冲 液或 10m m o l / L Tris 缓 冲 液 中 （p H 7. 5)。 8•通过电泳Ifxl纯化的D N A 样品来估计载体D N A 的浓度，将 步 骤 6 留下的样品作为
    浓度标记。 线性载体与寡核苷酸盒的连接 9 . 反应体系： 载 体 （一 般 1〜2fxl) 5Ong 200nmol/L 寡核苷酸盒 1. 0^1 I O X D N A 连接缓冲液 0. 5^1 T 4 D N A 连接酶 0. 5^1 加 H 2◦ 至总体积 5. 0/Ltl 室温孵育30m i n 。 同时建立不含插人序列的阴性对照连接体系。 感受态细胞的转化 10.将 3fxl连接产物与30〜50/J 感受态细菌混合，冰上孵育30m i n ，将剩余的连接反应 产物储存在一20°C 。 1 1 •将反应混合物在4 2 °C孵 育 3 5 〜 40s 。 立即置于冰上冷却2m i n ，加 人 700|u l L B 培养 液 ， 37°C振荡培养4 5 〜 60m i n 。 12•将一半培养液涂于包含50jug/m l 青霉素的L B 琼脂平板上， 37°C 培养过夜。 转化细菌的分析 1 3 . 在转化的第二天检查琼脂平板；经过转化的平板上的克隆应该比对照平板多。用灭 菌的枪头挑取2〜3 个克隆，并接种到5m l 含 有 50〜lOOfxg/m l 青霉素的L B 培养结 中。 3 7 °C振荡培养过夜。 14. 用柱分离试剂盒从转化菌中小量制备D N A 。将 D N A 溶 解 于 50^1溶解缓冲液或 10m m o l / L Tris 缓 冲 液 中 （p H 7. 5)。 插人一个典型的shRNA表达盒后，与克隆质粒相比酶切释放的DNA片段的大小增加40〜 5 0 对 碱 基 （如克隆质粒的Bam H I和 NozI酶切释放片段分别为327对 和 364对 碱 基 )。图 3A (见彩版）给出了构建的表达shRNA的质粒的酶切图谱。标识的限制酶适于进行限制 酶酶切分析和质粒的亚克隆。 15. 对质粒进行酶切分析（在 IOjbJ 反 应 体 系 中 切 割 0.3〜 0.5陴 的 D N A ) , 可以用 或 J V o d 来验证插入序列是否存在，并用克隆载体作为阴性对照。 插 人 shRNA后 ，载体的长度会增加40〜50bp (用 Bam H I和 N oiI切割的产物长度分别为 327bp、 364bp)。一个 典 型 的 shRNA表 达 载 体 的 图 谱 见 图 3A 。标出的酶可用于酶切分析 和亚克隆。 . 16•在步骤15鉴定出的阳性克隆用U 6-F 〇 r 引物和B G H -R e v 引物扩増。 构建双萤光素酶报道系统以评价效应因子 17.扩增目的基因c D N A 区域，这个区域包含所有的目的位点以及5'多克隆位点上游 100个 和 3'下 游 100个核苷酸。
    : 中 表 有 福 个 型 二 二 A = ^丄包白特异性®序列可以减少形成目的基因错误二级结构的机会。前引物和后引物分 占从S X A 〇1和 驗 1酶切位点，用于将1^产物定向克隆进psiCheck2 载体。确保酶切位 点外面还包含另外4〜6个核苷酸以提髙对P C R 产物的酶切效率。 18. 要克隆目的c D N A ，参照步骤4〜1 5 , 但某些步骤有所修改。在步骤9,插入序列的 摩尔数应是线性载体的2〜3 倍。在步骤1 5 , 酣 x / w I + JVGrt酶切释放出插入序列 来分析转化菌D N A 。 19. 通过酶切鉴定的阳性克隆，用 RLuc_F〇1^ TK_Rev引物扩增。 双萤光素酶报道系统与效应因子载体共转染 20. 在转染前16〜24h ，将细胞接种在2 4 孔 板 里 （每 孔 0.5m l )，当开始转染时，细胞 汇合度应达到60% 〜80% 。 2 1 . 每种细胞接种到3 个孔，为 所 有 的 样 品 （]V个）准 备 Lip/med (Lipofectamine 2000/培养液）混合液： Lip/m e d : 50 X JVjul 的基础培养液+1. 5X JVpl 的 Lipofectamine 2000 室温下孵育5〜l O m i n。 22. 混合报道D N A 和效应因子D N A (包括一个无关的效应因子作为对照）用于转染 (条件： IOOng 报道基因、 IOOng 效应因子、每孔 0 •5；xl Lipofectamine 2000): lOOng/f J 的报道基因 3今 1 lOOng/p l的效应因子 3. Oyl 基础培养液 50fxl Lip/med (见步骤 2〇) 50m1 混 匀 ，室 温 孵 育30min (见步骤21)。 23. 在孵育混合物的过程中，吸出24孔板中的培养液，向每孔加人300I山新鲜的全培养 液。或者只从每孔吸出200f J 旧培养液。 24. 将°5〇4步骤2 2 的混合物溶解在500W 全培养液中，向 3 个孔中每个孔加人200m 1。 • 528 •


    25.将混合物与细胞共同孵育（期间不需更换培养液）直到转染后 24 h 。

    26.吸出培养液，向每孔加人 150ul 被动裂解缓冲液（在双萤光素酶报道系统试剂盒中提供），室温下轻柔振荡培养 15 min 。

    27.在荧光/化学发光检测仪上测量报道基因的表达（参照双萤光素酶报道系统试剂盒的操作手册)。

    28 以内部对照萤火虫萤光素酶为标准，规格化所有样品目标特异性

    Renilla 萤光素酶的表达。设定对照组（转染无关效应因子的细胞）的表达效率为 1 00%，对照计算其他样品的相对表达水平。至少进行两次独立的平行实验，选择两个构建好的并证明高效表达效应因子的样品，用于进一步的研究。

    来源：丁香实验

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