放射免疫分析法的建立

 

第五节　放射免疫分析法的建立

　　一、放射免疫分析的基本 试剂

（一）标准品

标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。

（二）标记物

标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。

　　要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用 ¹²⁵ I时达5000～15000cpm。

（三）抗体

应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。

根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。

（四）B与F分离剂

以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制：

活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型）

　　右旋糖酐T ₂₀ 0.2g

加0.1mol/L PB 至100ml

电磁搅拌1h，然后置于变通冰箱冰箱待用。

（五）缓冲液

放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种，要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③巴比妥缓冲液；④Tris �HCl缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

　　在缓冲液中，除必须有弱酸及弱酸的盐成分外，还应根据不同检测项目加入下列物质：①保护蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明胶，浓度为0.1%～0.2%，用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂：多采用0.1%叠氮钠、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制剂：如测定心钠素等肽类激素时，要加入适量的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解；又如测定cAMP、cGMP时，需加入EDTA・2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂：在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时，必须加阻断剂，使和蛋白质相结合的激素，变为游离型。常用的阻断剂有8―苯胺―1―萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤ 载体 蛋白：采用二抗作B与F分离剂时，要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用PEG沉淀剂分离B、F，必须加适量γ球蛋白或正常人混合血清。

在神经肽的RIA时，常用PELH缓冲液，（按1000ml,pH7.6）：

0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

0.3mol/L EDTA・2Na　　　　　10.0ml

0.2%洗必泰溶液　　　　　　　10.0ml

溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

二、加样程序

由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：

（一）平衡饱和加样程序

1．基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

2．加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。

在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。因此，上述加样程序就更有必要，所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清，后加标记物。这样测定也比较稳定。

在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中，如果是双抗体分离法，抗原和标记抗原与抗体三者加样，可不分先后，有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序，但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24～48h，再加双抗体，继续温育24h，使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析，应用双抗体分离法，其流程比较长，这样的顺序同样可不分先后。

以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：

（1）加样（单位μl；总反应体积500μl）

　 标准曲线 样品 　 T NSB Bo 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 1ng 垂体 下丘脑 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 β-EP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 / / 样品 / / / / / / / / / 1 100 β-EP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 100

¹²⁵ -β-EP溶液 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 缓冲液 / 400 300 200 200 200 200 200 200 299 200

（2）孵育：4℃，24h

（3）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的CPM数。

（二）顺序饱和加样程序

1．基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。

应用顺序饱和加样，可以提高测定方法的灵敏度。Utiger在做人促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析时，将标记物延至第2天加入，发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间，仍可取得满意的结果。所以一般认为，在顺序饱和加样中，第1次温育时间可以长，而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见，认为顺序饱和加样，是使用过量抗体，会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量，温育时间缩短，在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物，这样既不影响加灵敏度，反而比较稳定，甚至可提高灵敏度。

2．加样程序　以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例（直接测定）。

（1）加样（单位μl；总反应体积600μl）

　 标准曲线 血浆 T NSB Bo 1Pg 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AVP