HFRS动物模型的研究和应用

 

三、HFRS动物模型的研究和应用

肾综合征出血热病毒（HFRSV），属布尼亚病毒科（Bungavividae）中的一个新属，称为汉坦病毒属。自1978年南朝鲜李镐汪首次以疫区黑线姬鼠肺分离到HFRSV（亦称汉坦病毒Hantaan Virus,HTNV）后，对其动物模型进行了众多的研究。

（一）HFRS感染动物模型

感染动物模型的亚临床感染，亦无明显病理变化，主要用于病毒分离和传代。目前有：非疫区黑线姬鼠、大白鼠、长爪沙鼠、家兔等。

1．黑线姬鼠

非疫区黑线姬鼠是最早用于病毒分离和实验研究的动物。据报道用各种途径（肌肉、皮下、肺内、鼻内、或经口）接种均可使黑线姬鼠感染。皮下和肺内接种0.1ml汉坦病毒或待检其其它材料后，10天左右肺部出现病毒，以后在肾、肝、颌下腺中可检出病毒。约接种后20天，肺中病毒滴度最高，以后逐渐下降，但150天后仍可检出。

黑线姬鼠为野生鼠类，常有野生啮齿类病毒的污染，加之来源、人工饲养、繁殖等问题较难解决，因而使用受到一定限制。

2．大鼠成鼠

1981年Leepw等将朝鲜出血热病毒接种到雌性、1月龄Wistar和Fisher大鼠。这是首次将该病毒接种于实验大鼠，肌肉接种0.5ml汉坦病毒后14-65天，肺内可发现其特异性抗原；接种后三周，血清中可检出特异性抗体，除脾脏亦可查到特异抗原外，与黑线姬鼠脏器的抗原分布相同。

朝鲜出血热病毒对实验室大鼠的适应，提供了无野生啮齿类病毒污染的实验模型。现已应用于特异性药物治疗研究。

3．长爪沙鼠成鼠

1983年朱智勇等发现长爪沙鼠对HFRSV敏感。六种途径（肺内、皮下、腹腔、口腔、肌肉）接种，第1代即可感染，无需传代适应；脏器内检出特异性荧光部位与黑线姬鼠相同。接种病毒后4天，肺组织中查见病毒抗原，5-7天过高峰，通常于10-14天消失。接种后8天，查到抗体，14天达高峰。长爪沙鼠可用多种宿主动物体内HFRSV的分离，且在较短时间内即可获得毒株。而且，这些毒株可用于疫苗的研制。

4．家兔

HFRSV感染的家兔，与长爪沙鼠成鼠一样，亦为无症状短期自限性隐性感染。不同来源的HFRSV，除口饲外，肌肉、腹腔、肺内、皮下接种均可使家兔感染，并能在体内连续稳定地传代，但不表现任何症状。接种后4天，有持续数天的病毒血症，7-14天可在多种器官内找到病毒抗原，以脾、小肠、胰腺中为明显，肺、肝、肾等组织内偶尔可见，8-9天抗原量最多，同时在血液中开始查到相应抗体，随抗体效价增长体内病毒抗原很快减弱，至第15天完全消失。

初步实验表明，R3和76/118株都能使乳兔感染，其表现与成兔相似，全身多种脏器组织内可检出病毒抗原，但其荧光亮度更强，提示乳兔对HFRSV更敏感。

（二）HFRS致病动物模型

致病动物模型为显性感性甚至死亡，并伴有明显病理改变。主要用于发病机理研究、药物筛选等。目前有小白鼠乳鼠、大鼠乳鼠、裸鼠及环磷酰胺处理的金黄地鼠。

1．小鼠乳鼠

Tasi等报道了第一个致病动物模型，即新生小白鼠（2-4龄）。相继发现CD-1、ICR、Balb/等品系乳鼠均对HFRSV敏感。颅内、腹腔、肌肉、皮下接种均可使其感染。我们的研究发现：颅内、腹腔联合接种与单纯颅内接种，在发病时间、抗原分布上无明显差别。但腹腔接种乳鼠发病时间要比脑腹联合接种及单纯脑内接种平均迟4-5天。病毒抗原广泛分布各脏器（脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺），脑内接种0.02ml经乳鼠传代适应的汉坦病毒76/118株（LD50、10-6・5/0.02ml），乳鼠第7天开始发病，表现为蜷缩、活动减少、耸毛、弓背、尾强直、后肢麻痹，直致死亡，发病规律。

乳鼠现已成功地用于病毒分离、繁殖高滴度HFRSV，并被用于研究不同来源毒株的毒力及测定疫苗效力和安全性、筛选抗病毒药物及研究发病原理。

2．大鼠乳鼠

Fishet大鼠（E344/N）出生后24小时内，分别颅内接种HFRSV76/118株和B-1株（分离自实验室大鼠），死亡率分别为18.8%、42.9％。腹腔分别接种上述两种毒株，观察至第50天，仍未见死亡。

3．金黄地鼠

每只地鼠腹腔一次注射200mg/kg环磷酰胺，48小时后，腹腔或皮下注射病毒悬液1ml，或脑内接种0.05ml。绝大多数动物在感染后7-9天病死。在病死地鼠的各器官均发现有HFRS病毒抗原，并分离到病毒。各器官的病理变化酷似人体出血热病变。

4．裸鼠

14-42天龄的CK-1无胸腺裸鼠，脑内接种104・4PFU（0.02ml）汉坦病毒76/118株后40天，表现有体重减轻、活动减少、站立不稳、嗜睡等，最后全部死亡。而其同龄同窝兔功能正常鼠不发病。

　　我们用乳鼠适应的汉坦病毒76/118株感染了21日龄NIH品系的无胸腺裸鼠，感染剂量2.5×10 ⁵ LD ₅₀ ，（脑腹联合接种，0.02ml/脑，0.05ml/腹）。最早于第8天开始发病，表现为活动减少、互相抱团、食欲减退、体重减少、弓背、后肢麻痹，于20天内全部死亡。而接种相同量病毒的同窝免疫功能正常鼠则不发病。脑、心、肝、脾、肺、肾均有特异抗原，脑内抗原荧光最亮。初步观察了人白细胞干扰素对裸鼠感染的保护作用，剂量为：20×10 ⁶ μ/kg，腹腔内给药，自病毒感染当天开始，连续用药6天，发现治疗组比对照组存活时间延长1.5-3天，进一步的研究正在进行中。

（三）灵长类和树�

灵长类的研究尚无肯定的结果。

非洲绿猴、脑内接种HFRSV后，观察7周，未见临床症状及病理变化。Amyx等发现猕猴和黑猩猩接种后，可有规律地出现短暂蛋白尿、病毒血症，偶见痰质血症。在日本，用HFRS病毒接种幼龄猕猴（Ｃynomolgus）后７周，可见有与HFRS病人相似的病理变化：肾、肺、脾、心脏和肝可见毛细血管扩张、部分脏器可见弥漫性血管内凝血（DIC）、肾髓质集合管退行性变、感染3-4周有蛋白尿，并在组织中检出抗原，但未观察到临床症状。看来猕猴可能有希望做为较好的致病研究模型。

　　国内未志勇等将R ₃ 株病毒接种三只恒河猴（3～4岁），研究HFRS病毒在猴体内的分布、增殖和排出，研究结果表明，接种病毒后3～5天即出现病毒血症，直至血液中检出抗体前2天止，持续8天之久；猴产生抗HFRS抗体时间在接种后第14天，且IgG和IgM抗体同时出现；病毒血症期直至产生抗体上，猴体内各器官组织未发现病毒增殖。此时粪便和尿都未分离出HFRS病毒。从而可推测HFRS病毒在猴体内增殖的部位可能是循环血细胞内，这与近年来证明该病毒在病人血细胞内增殖相符。

　　最近严玉辰等将A16株病毒接种于六只树�，每只由皮下和脑内混合接种10 ^-1 病毒悬液1ml。结果：1～2号树�于接种后7天死亡，经检测脏器抗原皆阴性，死后查血清抗体阳性。3～6号树�接种病毒后，经2～4次尿抗体检查均阴性，血清抗体皆阳性。接种病毒7天后，均有不同程度的体温增高现象。其中5号树�于接种病毒在9天死亡。抗原在树�脏器组织中的分布颇为广泛，但1～2号小兽血中有抗体，脏器内未检出抗原，何种原因尚待研究。初步看来此种小兽对HFRS病毒较敏感，但非理想的敏感动物。其不同年龄、不同毒株、不同剂量的实验，有待进一步深入研究。（本节常见病毒敏感动物的选择资料由王晶翼同志提供）。