TNT偶联网织红细胞裂解物系统问题与解答

互联网2013-09-05

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<a name="1"> 1)什么是TNT偶联网织红细胞裂解物系统？ TNT偶联网织红细胞裂解物系统为研究人员提供了一种可供选择的真核体外翻译系统，一种单管、偶联转录/翻译系统。将转录产物掺入到翻译混合物中，TNT偶联网织红细胞裂解物系统简化了体外翻译的过程，缩短了翻译所需的时间。标准兔网织红细胞裂解物翻译系统所用的RNA来源于用SP6、T3、T7RNA聚合酶启动子在体外合成的转录产物，需要3次分开的反应，每1个反应间需要多个步骤。TNT偶联网织红细胞裂解物系统消除了多步操操作带来的得率低的问题。</a>

<a name="2"> 2)TNT快速偶联转录/翻译系统和TNT偶联网织红细胞裂解物系统有何差别？ TNT偶联网织红细胞裂解物系统为研究人员提供了一种单管、偶联转录/翻译系统。TNT快速偶联转录/翻译系统将所有转录和翻译有关的组分，组合在TNT快速超级混合液中，简化了操作步骤，这些组分包括RNA聚合酶、核苷酸、盐、RNasin核酸酶抑制剂，研究人员只需加入模板和甲硫氨酸（一般是放射同位素标记）。相比而言，TNT快速偶联转录/翻译系统更方便（加样步骤少），无残留试剂。另外，镁和钾的浓度可作相应调整，以增加得率和翻译的保真度。</a>

<a name="3"> 3)TNT偶联网织红细胞裂解物能得到多少量的蛋白质？ 蛋白质的得率和模板有关，在50ul的反应体积中正对照质粒产生150-500ng的蛋白质</a>

<a name="4"> 4)一次反应用多少量的DNA？ 标准步骤用1ug的DNA。用0.2-2.0 ug的DNA可得到满意的结果。DNA的量大于1ug不增加蛋白质的量。</a>

<a name="5"> 5)标准兔网织红细胞裂解物系统能代替TNT兔网织红细胞裂解物系统？ 不，两个系统的设计不同。如将提供的裂解物系统替换，则不能获得最佳结果。</a>

<a name="6"> 6)能用别的来源的RNA聚合酶代替系统中的酶吗？所用的替代酶的量是多少？ 每一个TNT兔网织红细胞裂解物系统中的组分作了不同的设计。各组分作了最优的配方，替换一个组分会降低得率。比如不能在一个给定的系统中用T7 RNA聚合酶替换SP6 RNA聚合酶。每一个系统的反应中，RNA聚合酶的量适当，用别的RNA聚合酶会导致得率低。</a>

<a name="7"> 7)用TNT偶联网织红细胞裂解物系统翻译的模板序列有何要求？ 插入片段必须克隆在一个SP6、T3、T7 RNA聚合酶启动子的下游，在合适的翻译读码框中还有一个ATG。其它一些序列会影响最终得率，如起始密码子前后序列效应， 5`和3`非翻译序列， 5`帽类似物。 ATP位于Kozak翻译起始共有序列的模板[Kozak M(1990)Nucleic Acids Research 18,2828]，比不含这一共有序列的模板，翻译效率高。在编码区上游含有如EMCVmRNA的内核糖体进入位点，或3`末端含有poly(A)，可增加翻译效率。加入m7G(5)ppp(5)G类似物会抑制TNT偶联网织红细胞裂解物的翻译，因为这一游离类似物和翻译起始因子结合。</a>

<a name="8"> 8)用一种RNA聚合酶的启动子所得的表达是否高于其它序列？ 在正对照中，模板是超螺旋，含SP6聚合酶启动子所得的蛋白质的含量2-3倍高于T3或T7 RNA聚合酶启动子。但这一结果不适用于所有模板。</a>

<a name="9"> 9)系统提供的正对照是什么？所得蛋白的大小是多少？ TNT偶联网织红细胞裂解物系统的正对照，是一超螺旋的模板，编码荧光素酶，受适合的RNA聚合酶驱动。序列还含一段短的poly(A)片段。在SDS-PAGE胶上，正对照产生的荧光素酶的大小是62kDa。</a>

<a name="10"> 10)TNT偶联网织红细胞裂解物系统该使用线性或环型DNA？ 环型DNA和3种RNA聚合酶均能有效配套，线性DNA适用于T3、T7系统，用SP6 RNA聚合酶的翻译效率却大大降低。如用线性DNA（比如TNT T7快速偶联转录/翻译系统），应在RNA聚合酶启动子的上游有20bp的序列，以使启动子的结合有效。</a>

<a name="11"> 11)TNT偶联兔网织红细胞裂解物能否和犬的微粒体膜一同用于翻译后修饰？ 是的，TNT偶联兔网织红细胞裂解物能和犬的微粒体膜一同使用，作翻译后修饰，但产物的得率降低50-80%。</a>

<a name="12"> 12)用TNT偶联兔网织红细胞裂解物能得到的最大的蛋白质是多少？ 研究人员成功报道用TNT偶联兔网织红细胞裂解物能得到的最大的蛋白质是176kDa的蛋白质。 </a>