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酵母双杂交筛选

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第二章 酵母双杂交筛选
1. 操作流程
诱饵基因转化筛库宿主菌Y190――>含诱饵基因的Y190 保种――>诱饵基因的
自激活检测――>筛库(组织库或者小文库)――>挑选鉴定阳性克隆――>抽提阳
性克隆中PREY 质粒并在细菌中扩增――>猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共
同转化Y190,验证其相互作用
2. 方 法
2. 1 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190
1) 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜),
OD600 达到1.2 左右。
2) 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右,使
培养液OD600 达到0.6。
3) 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD),Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1,
865rpm),5 分钟离心收集菌体,弃上清。
4) 20ml ddH2O 重悬菌体,Eppendorf Centrifuge 5810R,700g,5 分钟离心收
集菌体,弃上清。
5) 20ml 1XTE/LiAundefined重悬菌体,Eppendorf Centrifuge 5810R ,700g,5 分钟离
心收集菌体,弃上清。
6) 根据每个转化需要50μl 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体,分装到
Eppendorf 管中,每管50μl 菌液。
7) 每管加约100ng Bait 基因质粒,5μl 预变性的Carrier DNundefined,500μl 1X
TE/LiAc/PEundefined。
8) 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。
9) 30 分钟后,每管加入15μl DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE),轻轻上下颠
第二章 酵母双杂交筛选
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倒混匀。
10) 42℃水浴热激20 分钟,每10 分钟上下颠倒混匀一次。
11) 冰浴5 分钟。
12) 700g,5 分钟离心收集菌体,弃上清。
13) ddH2O 洗涤一次菌体。
14) 利用残余液体重悬菌体,涂布于SD/-Trp 平板上。
15) 30℃培养箱培养。第2 天即可观察到克隆长出,第3 天克隆即长到所需大
小。
Carrier DNA: Herring Testes Carrier DNA,Denatured. Clontech. 10mg/ml.
未使用过的Carrier DNA 先100℃变性10 分钟,立即置于冰浴2 分钟,然后
再100℃变性10 分钟,之后置于冰浴上备用。已经使用过的Carrier DNA 只
需要100℃变性一次即可。
1XTE/LiAc: V10XTE:V10XLiAc:VH2O=1:1:8
1XTE/LiAc/PEG: V10XTE:V10XLiAc:V50%PEG=1:1:8
50%PEG: 50%为质量体积比。PEG3350 溶于ddH20 中一般需要加热溶解
10XTE: 0.1 M Tris-HCl, 10mM EDTA, pH7.5
10XLiAc: 1M LiAc, pH7.5
2.2 含Bait 基因质粒的Y190 保种
Bait 基因长出克隆后,一般用诱饵基因特异性引物直接在酵母菌落中PCR
鉴定是否转入正确的Bait 基因的质粒,然后把经鉴定正确的克隆进行保种。
2.2.1 酵母菌落PCR
1) 用含Bait 基因的质粒作为阳性对照,用宿主菌Y190 作为阴性对照
2) 按照下列反应体系进行PCR
ExTaq Premix(Takara) 10μl (2X )
5’Primer 0.5μl (10μM)
3’Primer 0.5μl (10μM)
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ddH20 8.9μl
菌 0.1μl
3)按照下列反应条件进行PCR
95℃ 5 分钟
94℃ 30 秒
58℃ 30 秒
72℃ 2 分钟
72℃ 5 分钟
72℃延伸2 分钟是针对小于2Kb 的Bait 基因,对于长于2Kb 的Bait 基因要相
应延长时间。
4)PCR 产物进行电泳检测
2.2.2 阳性克隆保种
1) 将阳性克隆接种到3ml 相应液体培养基中,30℃振荡培养2-3 天。
2) 700g,5 分钟,离心收集菌体。
3) 加入1:1 的液体培养基和Sterile Glycerol Solutioundefined混合溶液。
4) 充分悬浮菌体,放于-80℃保存。
Sterile Glycerol Solution: 65%(V/V) glycerol, 0.1M MgSO4, 0.5mM Tris-HCl, pH7.4
2.3 Bait 基因的自激活检测
一般采用膜检的方法,检测LacZ 基因的表达情况。膜检方法如下:
1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。
2) 将滤纸完全浸于液氮中,时间长于30 秒,取出后晾干。
3) 培养皿加入适量显色液~A新鲜配制),垫一层滤纸,让其完全湿润,将冻溶
后的滤纸铺在上面,使显色液渗透到表层。9cm 培养皿加2ml 显色液,15cm
培养皿加5ml 显色液。
4) 盖上皿盖,放置在37℃培养箱中,避光放置。
5) 20 分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录,一般以3 小时为准,特殊情
况下可以看过夜是否变蓝。
6)反应过后打开皿盖,将滤纸烘干,保存并记录。
35cycles
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显色液: 100ml Z buffer,0.27ml β�mercaptoethanol,1.67ml X-gal
Z buffer: 16.1g/L Na2HPO4・7H20, 5.50g/L NaH2PO4・H2O, 0.75g/L KCl, 0.246g/L
MgSO4・7H2O,pH7.0。室温可以存放一年。
X-gal: X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside) 溶于DMF
(N,N-dimethylformamide)中,终浓度为20mg/ml。
2.4 诱饵基因筛库
2.4.1 转化法筛选组织库
1) 5-10 个2mm 克隆接种于1ml SD/-Trp 液体培养基中,混匀后转入150ml
SD/-Trp 振荡培养20 小时(过夜),至 OD600=1.2 左右。
2) 150ml 培养液转入1000ml YPDA(YPD+Adenine)中混匀,此时OD600=0.2~0.3。
3) 培养约4~5 小时至OD600>0.6。
4) 500ml 离心管收集菌液。Beckman Coulter Centrifuge Avanti J-25(以下步骤均使
用此离心机),700g,5 分钟,RT(室温)。同时将2000μl Carrier DNA 预变性两次。
5) 500ml ddH2O 洗涤一次,700g, 5 分钟,RT,收集菌体。
6) 30ml 1X TE/LiAC 洗涤菌体(预先配制50ml 1X TE/LiAC), 转入100ml 离心管。
7) 700g, 5 分钟, RT。(预先配制50ml 1XTE/LiAC/PEG)。
8) 加入12ml 1X TE/LiAc 重悬菌体。
9) 加入100~500μg 文库DNA, 2000μl 预变性的Carrier DNA,轻轻混匀。
10)加入50 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。
11)30℃孵育45 分钟,每15 分钟混匀一次.
12)加入3.2ml DMSO, 轻轻混匀.
13)42℃热激20 分钟,每10 分钟混匀一次.
14)冰浴5 分钟.
15)700g,5 分钟,收集菌体.
16)加入1000ml YPDA,30℃振荡培养60 分钟.
17)700g, 5 分钟,收集菌体.
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18) 加入2ml 0.9% NaCl 悬浮菌体,终体积约5ml 左右。取20μl 菌液做滴度测
定, 其余菌液200μl/ 块, 涂布于15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM
3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长
状态。
19) 滴度(转库效率)测定: 20μl +180μl NaCl(0.9%) 1:10 ;
20μl +180μl NaCl(0.9%) 1:100;
20μl +180μl NaCl(0.9%)1:1000;
20μl +180μl NaCl(0.9%) 1:10000
20μl +180μl NaCl(0.9%) 1:100000
1:1000; 1:10000;1:100000 三种浓度各取100μl 涂布SD/-Trp/-Leu 平板
20) 转库效率的计算:对生长在SD/-Trp/-Leu 平板上的克隆计数,挑选克隆数在
30-300 之间稀释度计算转库效率
转库效率计算实例:
.. 在1:10000 转库效率计数平板上长出100 个克隆(稀释度=0.0001)
.. 总悬浮体积= 5ml
.. 文库质粒用量=100μg
转库效率 = = 5 X 105cfu/μg
21)筛库完成,菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14 天后,会有阳
性克隆生长出来,阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。
从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。
2.4.2 筛选小文库
2.4.2.1 转化法
1)5~10 个2mm 克隆接种于2ml SD/-Trp 液体培养基中,摇20 小时(过夜),至
OD600=1.2 左右。
2) 2ml 培养液转入20ml YPDA 中,此时OD600=0.2~0.3。
克隆数(cfu)X 总悬浮体积
涂板体积X 稀释度X 文库用量(μg)
=cfu/μg DNA
100cfu X (5mlX103μl/ml)
100μl X 0.0001 X 100μg
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3) 培养约4~5 小时至OD600>0.6。
4) 用50ml 离心管收集菌液,Eppendorf Centrifuge 5810R(以下步骤均使用此离心
机),700g,5 分钟,RT。同时将Carrier DNA 预变性两次。
5)10ml ddH2O 洗涤一次,700g, 5 分钟,RT,收集菌体。
6) 10ml 1X TE/LiAc 洗涤菌体(预先配制1X TE/LiAc)700g, 5 分钟, RT。(预先配
制1XTE/LiAC/PEG)。
7) 加入600μl 1X TE/LiAc 重悬菌体。
8) 加入2μg 小文库DNA,20μl 预变性Carrier DNA,轻轻混匀。
9) 加入2.5 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。
10) 30℃孵育45 分钟,每15 分钟混匀一次。
11) 加入160μl DMSO, 轻轻混匀。
12) 42℃,热激20 分钟,每10 分钟混匀一次。
13) 冰浴5 分钟。
14) 700g,5 分钟,收集菌体。
15) 加入20mlYPDA,30℃摇60 分钟。
16) 700g,5 分钟,收集菌体。
17) 加入200μl 0.9%NaCl 悬浮菌体,取20μl 菌液做滴度测定,其余菌液涂布于一
块15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM 3-AT 平板上。第三天起要注意观察平板酵
母克隆生长状态。
18) 滴度测定:方法同筛选组织文库。
19)筛库完成,菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14 天后,会有阳
性克隆生长出来。阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。
从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。
2.4.2.2 Mating 法
1)将带有小文库基因的质粒分别转入Y187 中(方法见1),保存甘油菌(方法见
2.2)。将甘油菌扩增并保存到96 孔板(Corning Incorporated costar 3599)中,每
个孔对应一条小文库基因,-80℃冻存备用。
2) 将Y190 菌液(携带pGB-诱饵基因质粒)平铺在15cm 培养皿中, 用96 孔
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replicator(sigma)影印到15cm SD/-Trp 平板上。
将Y187 菌(携带pACT2-小文库基因质粒)用96 孔replicator 从96 孔板中影印
到15cm SD/-Leu 平板上。
3)生长48-72 小时,观察菌落生长情况,每个菌落长至3-5mm,分别印至绒布上。
再从绒布上影印到15cm 2xYPD 平板上。Y190 菌(携带PGB-X 诱饵质粒)的
96 个克隆和Y187 菌(携带pACT2-小文库基因质粒)的96 个克隆一一对齐,
影印到一起,使其发生Mating。30℃培养20~24 小时。
4)Mating 完成, 再用绒布把菌落从2xYPD 平板影印至
SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上。
5)30℃培养5~14 天,在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板生长出来的克隆做膜检
(方法见3)。
6)对膜检显蓝色的菌落做PCR 鉴定(方法见2.1)是否为对应的小文库基因,并用
此基因的prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。
2.4.3 注意事项
1) 2XYPD 平板培养基应该稍微薄一些,这样培养基比较透明容易观察,可以尽
量保证Y 190 菌和Y187 菌克隆对齐。
2) 因为Y190 为Adenine 缺陷菌株,所以菌落为红色。而Y187 非Adenine 缺陷
菌株。所以菌落为白色。为了便于操作,一般先把Y187 菌影印到2XYPD
平板,然后再影印Y190 菌。
3)Mating 时应该设置阳性对照,以便监测Mating 情况是否良好。
2.5. 抽提酵母质粒
1) 膜检变蓝的阳性克隆用牙签涂布在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上,约
2cm2,然后放置于30℃培养箱中培养3~4 天。
2) 取一Eppendorf 管,加入30μl 5u/μl Lyticase。把菌用牙签刮到lyticase 中,Vortex
充分悬浮。37℃孵育30 分钟。
3) 加入170μl Lysis Buffer 使终体积为200μl。再加入200 μ l 玻璃珠
(425-600microns),200μl 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),vortex 剧烈振荡5 分钟。
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4) 12,000rpm 离心10 分钟,将上清转入一干净Eppfendorf 管中。注意,不要
把蛋白转移过去。
5) 加入8μl 10M NH4Ac 和500μl 无水乙醇,混匀,-80℃放置1 小时。
6) 12,000rpm 离心10 分钟,去上清。
7) 加入500μl 70%乙醇洗涤沉淀,12,000rpm 离心5 分钟。
8) 弃上清,真空抽干沉淀。
9) 将沉淀重悬于10μl ddH2O 中,一般取2~3μl 转化大肠杆菌。
Lyticase: 将Lyticase 干粉溶解在1XTE 中,终浓度为5u/μl。
Lysis Buffer: 50mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% Triton X-100 , 0.5% SDS
2.6 酵母质粒的扩增
一般用电转的方法,把从筛库所得的阳性克隆中抽提的Prey 质粒在大肠杆
菌中扩增。
2.6.1 大肠杆菌电转感受态制备
1) 挑一单克隆接入3ml LB 培养基,摇培14~16 小时至 OD600=1.0~1.2
2) 将摇培后的菌液转接1L LB 培养基, 摇培4~5 小时至OD600=0.7-0.8
3) 离心收菌,10ml 冰水溶解
4) 5000g,2oC 离心10 分钟收菌,400ml 冰水将菌重悬,冰浴10 分钟
5) 5000g,2oC 离心10 分钟收菌,40ml 预冷10%甘油重悬,冰浴10 分钟
6) 5000g,2oC 离心10 分钟收菌,加1ml 10%甘油重悬
7) 用枪测量重悬后的菌液体积,加入与菌液等体积的10%甘油(注:等体积10%
甘油指重悬后的菌液体积减去1ml。例:加入1ml10%甘油后重悬菌液体积为
4ml,则加入10%甘油量为3ml)
8) 分装到Eppendorf 管中,每管100μl,冰上操作。
9) -80oC 冰箱保存。
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10) 取出两管做阴性、阳性对照。
LB:10g/L 蛋白冻,10g/L NaCl;5g/L 酵母提取物。121oC,20 分钟灭菌。
10%甘油:V 甘油:V 水=1:9。
2.6.2 电 转
1)从-80oC 冰箱取出感受态,至冰上溶解。同时,将电转杯至冰上冷却,打开电
转仪准备30 分钟。
2)感受态溶解后,将要转化的质粒(或连接产物或其他要转化的物质)加入感受态,
用枪吹打均匀(注意,不要产生气泡)。电转时有必要进行阴性对照、阳性对
照,以检验感受态是否被污染及感受态是否正常,有利于在出现问题时寻找
原因。
3)将混合后的感受态加入预冷的电转杯(Eppendorf,CAT.No.4307000569)。(注意,
不要产生气泡)
4) 擦干电转杯上电极两边的壁。
5) 将电转杯放入电转仪,启动电极。
6) 电击后,用1ml SOundefined将感受态洗出,37oC 孵育45 分钟。
7) 6,000rpm,3 分钟离心收菌。
8) 涂板。
不同电转杯的最适电压各不相同,经实验:
1mm 电转杯的最适电压为1900-2200V
4mm 电转杯的最适电压为2300-2500V
8mm 电转杯的最适电压为2500-2700V
SOC: 20g/L 蛋白胨,5g/L 酵母提取物,0.5g/L NaCl,2.5mM KCl,pH7.0。121oC,
20 分钟灭菌。冷却至60 oC 以下时,每升加入20ml 灭菌的1M 葡萄糖溶
液。该溶液使用前每升加入5ml 灭菌的2M MgCl2。
2.7 Prey 质粒与Bait 质粒共转Y190(参考1)
1) 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜),
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OD600 达到1.2 左右。
2) 将这3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数确定)YPD 中培养4 小时左右,使
培养液OD600>0.6。
3) 50ml 离心管收集菌液,700g,5 分钟离心收集菌体,弃上清。
4) 20ml ddH2O 重悬菌体,700g,5 分钟离心收集菌体,弃上清。
5) 20ml 1XTE/LiAc 重悬菌体,700g,5 分钟离心收集菌体,弃上清。
6) 根据每个转化需要50μl 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体,分装到Eppendorf
管中,每管加50μl 菌液。
7) Prey 质粒分别与Bait 质粒和pGB 质粒(无Bait 基因)共转,每种质粒都加入约
300ng;另外再加入5μl 预变性的Carrier DNA,500μl 1XTE/LiAc/PEG。
8) 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。
9) 每管加入15μl DMSO,轻轻上下颠倒混匀
10) 42℃水浴热激20 分钟,每10 分钟上下颠倒混匀一次。
11) 冰浴5 分钟。
12) 700g,5 分钟离心收集菌体,弃上清。
13) ddH2O 洗涤一次菌体。
14) 利用残余液体重悬菌体,涂布于SD/-Trp/-Leu 平板上。
15) 30℃培养箱培养。第2 天即可观察到克隆长出,第3 天克隆即长到所需大小。
16) 用滤纸印大约十几个克隆进行膜检(方法见3)。

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