单层贴壁细胞-细胞毒性试验-四唑盐（MTT）比色法-实战篇

单层贴壁细胞四唑盐（MTT）比色法

仅供参考 MTT常用浓度为5mg/ml;

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《动物细胞培养--基本技术指南》

注：此书中MTT浓度为50mg/ml

1、药物的细胞毒性

四唑盐（MTT）比色法

操作步骤

接种细胞

（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。

（2）离心细胞悬液,使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。

（3）将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。

（4）用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。

（5）将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。

（6）将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。

添加药物

（7）用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。

（8）对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。

（9）在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。

（10）在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。

（11）向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。

（12）将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。

生长期

（13）在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。

（14）每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。

存活细胞数的估算

（15）在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。

（16）用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。

（17）弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲?结晶。

（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。

（19）立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。

分析