牛支原体（mycoplasma）抗体酶联免疫分析（ELISA）

 牛支原体（ mycoplasma ）抗体 酶联免疫 分析（ ELISA ）

试剂 盒使用说明书

本试剂仅供研究使用          目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本 中 支原体抗体 的 含量。

实验原理 ：

本试剂盒应用双抗 原 夹心法测定 标本 中 牛支原体抗体 水平。用纯化的 牛支原体 抗 原 包被微孔板，制成固相抗 原 ，往包被单抗的微孔中依次加入 支原体抗体 ，再与HRP标记的 牛支原体 抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物 ，经过彻底洗涤后 加 底物TMB显色。TMB在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 牛支原体 抗体 呈正相关。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度（OD值）， 通过标准曲线 计算样品 中 牛 支原体 抗体 浓度。

试剂盒组成 ：

试剂盒组成	48孔配置	96孔配置	保存
说明书	1份	1份
封板膜	2片（ 48 ）	2片（ 96 ）
密封袋	1个	1个
酶标包被板	1 ×48	1 ×96	2-8℃保存
标准品： 36  ng/L	0.5ml× 1 瓶	0.5ml× 1 瓶	2-8℃保存
标准品稀释液	1.5ml× 1 瓶	1.5ml× 1 瓶	2-8℃保存
酶标试剂	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
样品稀释液	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
显色剂A 液	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
显色剂B 液	3 ml× 1 瓶	6 ml× 1 瓶	2-8℃保存
终止液	3ml× 1 瓶	6ml× 1 瓶	2-8℃保存
浓缩洗涤液	（20ml × 20 倍）× 1 瓶	（20ml × 30 倍）× 1 瓶	2-8℃保存

 

样本处理及要求 ：

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8 ℃的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20 ℃保存，但 应 避免反复冻融 .

7.  不能检测含NaN3的样品 ，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。

操作步骤

1.  标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 100 μ l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50 μ l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 100 μ l分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50 μ l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l弃掉，再各取 50, μ l分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50 μ l分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50 μ l，混匀后从第七、第八孔中分别取 50 μ l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50 μ l，混匀后从第九第十孔中各取 50 μ l弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50 μ l，浓度分别为 24  ng/L ， 16  ng/L  ， 8  ng/L ， 4  ng/L ， 2  ng/L ）。

2.  加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、 待测样品孔 。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μ l，然后再加待测样品 10 μ l（样品最终稀释度为 5 倍）。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻 晃动 混匀 。

3.  温育：用封板膜封板后置37 ℃温育3 0 分钟 。

4.  配液：将30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀释后备用。

5.  洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干 ，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶标试剂50 μ l，空白孔除外 。

7.  温育：操作同3 。

8.  洗涤：操作同5 。

9.  显色：每孔先加入显色剂A50 μ l，再加入显色剂 B50 μ l，轻轻震荡混匀， 37 ℃避光显色15分钟.  

10.  终止：每孔加终止 液50μl ，终止反应 （此时蓝色立转黄色） 。

11.  测定：以空白空调零， 4 50 nm波长依序测量各孔的 吸光 度（OD 值） 。   测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

注意事项：

1．  试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．  浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出，稀释时可在水浴中加温助溶 ，洗涤时不影响结果。

3．  各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．  请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后 乘以 总稀释倍数（ ×n×5 ）。

5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．  底物请避光保存。

7．  严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．  所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．  本试剂不同批号组分不得混用。

10.  如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

计算 ：

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，     

在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD       

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以 稀释      

倍数 ；或用标准物的浓度与OD 值计算出标       

准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值       

代入方程式，计算出样品浓度，再乘以 稀释      

倍数 ，即为样品的实际浓度。                   

  

                                              

 

（此图仅供参考）

 

 

 

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。

2.批内与批见应分别小于 9% 和 11%

 

                 

                            

保存条件及有效期：

1.试剂盒保存： ；2-8 ℃ 。

2．有效期： 6 个月

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