生物大分子样品的保存

互联网2013-09-05

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生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。 影响生物大分子样品保存的主要因素有： ⑴空气：空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。空气中微生物的污染可使样品腐败变质，样品吸湿后会引起潮解变性，同时也为微生物污染提供了有利的条件。某些样品与空气中的氧接触会自发引起游离基链式反应，还原性强的样品易氧化变质和失活，如维生素C、巯基酶等。 ⑵温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10℃，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加1～3倍。因此通常绝大多数样品都是低温保存，以抑制氧化、水解等化学反应和微生物的生成。 ⑶水份：包括样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。 ⑷光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，对生物大分子制品影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。 ⑸样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，通常可从文献和手册中查得或做实验求得，因此正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度就十分重要。 ⑹时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。 现以保存蛋白质和酶为例： ⑴低温下保存：由于多数蛋白质和酶对热敏感，通常35℃～40℃以上就会失活，冷藏于冰箱一般只能保存一周左右，而且蛋白质和酶越纯越不稳定，溶液状态比固态更不稳定。因此通常要保存于－5℃～－20℃，如能在－70℃下保存则最为理想。极少数酶可以耐热：如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃；蔗糖酶在50℃～60℃可以保持15 min～30 min不失活。还有少数酶对低温敏感，如鸟肝丙酮酸羧化酶25℃稳定，低温下失活，过氧化氢酶要在0℃～4℃保存，冰冻则失活，羧肽酶反复冻融会失活等。 ⑵制成干粉或结晶保存：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定的多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，－15℃下可保存8年。通常，酶与蛋白质含水量大于10％，室温低温下均易失活，含水量小于5％时，37℃活性会下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于10％，抑制化学活性，含水量要小于3％。此外要特别注意酶在冻干时往往会部分失活。 ⑶在保护剂下保存：很早就有人观察到，在无菌条件下，室温保存了45年的血液，血红蛋白仅有少量改变，许多酶仍保留部分活性，这是因为血液中有蛋白质稳定的因素，为了长期保存蛋白质和酶，常常要加入某些稳定剂：例如：①惰性的生化或有机物质：如糖类、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定的疏水环境。②中性盐：有一些蛋白质要求在高离子强度（1 mol/L～4mol/L或饱和的盐溶液）的极性环境中才能保持活性。最常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。使用时要脱盐。③巯基试剂：一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓馒氧化为磺酸或二硫化物而变性，保存时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。 总之，对样品的保存必须给以只够的重视，一些常用酶的保存条件可参见《生物化学制备技术》（苏拔贤主编）一书中的"一些酶保存的条件和稳定性"表，其他各种生物大分子和生物制剂的保存条件，可查阅有关的文献和酶学手册。 6. 分离纯化方法的选择 生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。由本章前述的生物大分子制备的各种特点可以看出，分离纯化方案必然是千变万化的。 制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：① 以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。② 以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。③ 以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。④ 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。 表2-2 各种主要分离纯化方法的比较： 方法 原理 优点 缺点 应用范围 沉淀法 蛋白质的沉淀作用 操作简便、成本低廉、对蛋白质和酶有保护作用，重复性好 分辨力差，纯化倍数低，蛋白质沉淀中混杂大量盐分 蛋白质和酶的分级沉淀 有机溶剂沉淀 脱水作用和降低介电常数 操作简便，分辨力较强 对蛋白质或酶有变性作用，成本较高 各种生物大分子的分级沉淀 选择性沉淀 等电点、热变性、酸碱变性等沉淀作用 选择性较强，方法简便，种类较多 应用范围较窄 各种生物大分子的沉淀 结晶法 溶解度达到饱和，溶质形成规则晶体 纯化效果较好，可除去微量杂质，方法简单 样品的纯度、浓度都要很高，时间长 蛋白质或酶等 吸附层析 化学、物理吸附 操作简便 易受离子干扰 各种生物大分子的分离、脱色、和去热源 离子交换层析 离子基团的交换 分辨力高，处理量较大 需酸碱处理树脂平衡洗脱时间长 能带电荷的生物大分子 凝胶过滤层析 分子筛的排阻效应 分辨力高，不会引起变性 各种凝胶介质昂贵，处理量有限制 分子量有明显差别的可溶性生物大分子 分配层析 溶质在固定相和流动相中分配系数的差异 分辨力高，重复性较好，能分离微量物质 影响因子多，上样量太小 用于各种生物大分子的分析鉴定 亲和层析 生物大分子与配体之间有特殊亲和力 分辨力很高 一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大 各种生物大分子 聚焦层析 等电点和离子交换作用 分辨力高 进口试制昂贵 蛋白质和酶 固相酶法 待分离物与固相载体之间有特异亲和力 分辨力高，用于连续生产 有局限性 抗体、抗原、酶和底物 等电聚焦连续电泳 等电点的差异 分辨力很高，可连续制备 仪器试剂昂贵 蛋白质和酶 高速与超速离心 沉降系数或密度的差异 操作方便，容量大 离心机设备昂贵 各种生物大分子 超滤 分子量大小的差异 操作方便，可连续生产 分辨力低，只能部分纯化 各种生物大分子 制备HPLC 凝胶过滤、离子交换、反向色谱等 分辨力很高，直接制备出纯品 制备柱和HPLC仪器昂贵 各种生物大分子 在分离纯化流程中，早期和晚期的分离纯化方法的选择有明显的不同： ⑴ 早期分离纯化 1) 特点：①粗提取液中物质成份十分复杂。②欲制备的生物大分子浓度很稀。③物理化学性质相近的物质很多。④希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。 2) 对所选方法的要求：①要快速、粗放。②能较大地缩小体积。③分辨力不必太高。④负荷能力要大。 3) 可选用的方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附、胖柱交换）；亲和层析等。 ⑵晚期分离纯化 1) 可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。 2)要注意的一些问题： ①盐析后要及时脱盐。 ②用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10～1/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。 ③必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，例如分级有机溶剂沉淀，分级盐析，连续两次凝胶过滤或离子交换层析等。 ④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。例如吸附不可以放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析的上样量可以不受限制，只要不超过柱交换容量即可。 ⑤分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下（如在冷室中）进行。 ⑥得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，－20℃ 或 －70℃保存。