酵母感受态细胞的制备方法

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酵母感受态细胞制备可以：(1)用于建立酵母转化体系;(2)用于酵母表达系统构建;(3)用于酵母其他分子 生物学研究。

一、试剂与耗材

1. 试剂

细菌用-酵母提取物(Fisher)、 细菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、细菌用-琼脂 粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA(Invitrogen)、酵母无氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-吗啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。

2. 仪器

水浴锅(VWR)、离心机(eppendorf )、30 °C摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。

二、 试剂配方

1. YPDA液体或固体培养基

(1)1%酵母提取物： 10 g/L

(2)2%胰蛋白胨： 20 g/L

(3)2%葡萄糖：20 g/L

2. 转化液

(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v)：260 μl

(2)1 M醋酸锂：36 μl

(3)SsDNA(10 mg/ml)：10 μl

(4)质粒 ：3 μl

(5)总计：360 μl

3. YNB+ MA 培养基(100 ml)

(1)YNB：0.67 g

(2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM )：0.39 g

(3)腺嘌呤：0.01 g

(4)琼脂 粉：2g

(5)葡萄糖：2g

三、制备步骤

1. 在转化实验的两天前，于YPDA培养基的平皿上活化酵母菌株。

2. 转化前一天，挑取活化的酵母细胞(单克隆)于YPDA液体培养基中，30°C，200 rpm培养过夜。

3. 将培养过夜的酵母细胞液按1：3的比例转接与新的YPDA液体培养基中，于30°C摇床内，200 rpm培养4 h。

4. 3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞，用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞。

5. 再次3 000 g 离心 5分钟。

6. 用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞，并转入适宜的离心管中，20°C ，3 000 g 离心 5分钟。

7. 用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油，10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。

8. 将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。

9. 将管放入塑料盒或者纸盒中(逐步梯度冷冻能够增强酵母的存活率)。

10. 将装有酵母细胞的盒子放入-80°C冰箱。(细胞在-80°C能够保存一年以上)。