受体菌感受态细胞的制备方法

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目的与原理

当细菌 处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌 处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组 基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。

二、材料和方法

1. 材料：大肠杆菌

2. 仪器：

离心机 ，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜

3. 试剂

LB培养基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高钴

TFB：10Mm MES(pH6.3)

45Mm MnCl2

10Mm CaCl2

10Mm KCl

三、操作步骤

大肠杆菌在LB培养基平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌到对数期。取1ml培养物7000rpm，离心3min，收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙(或TFB)，放置于冰浴，即得感受态细胞，此细胞可现用，也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中，投入液氮，然后储于-70℃保存。

四、结果 (略)

五、注意事项

一般地，新制备的感受态细胞48h后转化效率降低，15d后失效。因此，感受态细胞不能保存太久，4℃保存一周，但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔，损伤感受态细胞。