Sepharose CL

相关专题

 

(一)　原理
　　葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物 IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
　　(二)　操作步骤
　　用0.1M PH8.0 磷酸缓冲液 浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml
　　上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)
　　　　　　　　　　　↓
　　装柱后用0.1M PH8.0磷酸缓冲液 平衡
　　　　　　　　　　　↓
　　标本可用硫酸铵粗提物，先10,000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤。
　　上样前用1M PH9.0 Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜
　　　　　　　　　　　↓
　　加样，一般按25～30mgIgG／g湿胶比例加样，室温作用15min,0.1M PH8.0磷酸缓冲
　　液充分淋洗至淋洗液OD值为〈0.02。
　　　　　　　　　　　↓
　　用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱，流速20ml／h。如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0；纯化
　　IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1M PH3.0醋酸盐缓冲液或0.1M PH3.0 Glycine-HCl
　　缓冲液洗脱。
　　　　　　　　　　　↓
　　用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液
　　　　　　　　　　　↓
　　收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定
　　(三)　试剂器材
　　1.　SPA-Sepharose CL-4B(pharmacia)
　　2.　磷酸缓冲液 0.1M PH8.0＋0.02％ NaN３
　　3.　枸椽酸缓冲液　0.1M PH6.0　┐
　　　　　　　　　　　0.1M PH4.0　├＋0.02％ NaN3
　　　　　　　　　　　0.1M PH3.0　┘
　　4.　1M PH9.0 Tris溶液
　　5.　再生缓冲液(1) 0.1M Tris含0.5M NaCl调正PH至8.5＋0.02％NaN3；(2) 0.1M
醋酸钠含0.5M NaCl调正PH至4.5＋0.02％NaN3。
　　6.　1～10ml柱体积的玻璃柱或塑料柱
　　(四)　注意事项
　　1.　SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法:先用10倍柱体积0.1M PH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1M PH4.5醋酸钠缓冲液含0.5M NaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1M PH8.0磷酸缓冲液 平衡，4℃贮存。
　　2.　SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用于:(1)除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性；(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； (3)回收或纯化免疫复合物。
　　3.　　、狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。