制备抗体Sepharose 偶联物

1.  1 ~30 mg/ml 的抗体在 4℃对 0.1 mol/l NaHCO₃ / 0.5 mol/l NaCl透析 24 h，期间换液3次。透析液的体积应500倍于抗体溶液。

2.  于4℃10 000 g 离心1 h，除去聚集体。

 

3.  取小份上清测A₂₈₀确定抗体的浓度。用0.1 mol/l NaHCO₃ / 0.5 mol/l NaCl稀释抗体至5 mg/ml，于4℃保存。测此溶液的A₂₈₀。

4.  让浆状的Sepharose在烧杯中沉降，吸出并弃上清。称出与抗体溶液体积相等的Sepharose。

 

5.  用Whatman 1号滤纸、布氏漏斗、Erlenmeyer三角抽滤瓶并将之连接到水泵上组装 一套过滤装置，以10倍体积的水洗Sepharose

6.  将Sepharose移至50 ml 烧杯，加入等体积的0.2 mol/l Na₂CO₃。

7.  在室温按每100 ml Sepharose加3.2 ml CNBr/乙腈的量活化Sepharose。在磁力搅拌器轻柔搅拌下，慢慢用巴斯德吸管滴加CNBr，时间在1 min 以上，然后继续轻柔搅拌5 min。

 

8.  按步骤5快速过滤Sepharose，抽气至半干状（即抽至成块状的Sepharose干裂，并失去光泽）。

9.  用10倍体积的冰冷1 mmol/l HCl洗涤，接着以2倍体积的0.1 mmol/l HCl洗。

10.  以足够的冰冷0.1 mmol/l HCl让Sepharose复水，使之重新恢复光泽，但液体不要超出其表面。

 

11.  立即将称量好的Sepharose移至一烧杯，加入溶解于0.1 mol/l NaHCO₃ / 0.5 mol/l NaCl中的等体积抗体溶液。用磁力搅拌器室温搅拌2 h 或4℃过夜。

 

12.  加入50 mmol/l 的pH8.0的甘氨酸（或乙醇胺）溶液，以饱和Sepharose上的剩余活性基团，并让胶浆沉降。吸出部分上清，离心去残余Sepharose后，测其A₂₈₀，并与步骤2测出的抗体溶液的浓度比校，以确定偶联效率。

13.  抗体-Sepharose保存于TSA溶液。