种子蛋白质系统分析：种子蛋白质亚基分析（SDS

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一、目的
蛋白质分子有单链、双链和寡聚蛋白等组成形式，组成蛋白质分子的单条肽链又称亚基。通过对天然蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性蛋白的SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 的比较，可以研究种子蛋白质分子组成和结构。另外，SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定亚基分子质量的好方法。通过本实验，学习SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、技术和实际应用。

二、原理
用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（琉基乙醇或二硫苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS 发生1 : 1.4 的定量结合。SDS 使蛋白质亚基带上大量负电荷，掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。亚基的构象均呈长椭圆棒状，各种蛋白质亚基-SDS 复合物表现出相等的电荷密度。在电场中其迁移速率仅与亚基分子质量有关，因此，SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳 可以进行蛋白质亚基分离，并用来测量蛋白质亚基的分子质量。

三、仪器、试剂和材料
1．仪器
( 1）稳压稳流电泳仪
( 2）垂直板电泳槽
( 3）微量注射器
( 4）烧杯50ml X2
( 5）白瓷盘
( 6）脱色摇床
( 7）吸管0.5ml X 2 , 5mlx2 , 10mlx3
( 8）真空泵
( 9）台式高速离心机
2．试剂
( 1 ) 2％琼脂2g 琼脂加电极缓冲液100 ml，水浴中溶化。
( 2）电极缓冲液Tris 6g , Gly28.8g , SDS 2g ，去离子水溶解后，用Hcl 调pH 值至8.3，水定容至2000ml 。
( 3 ) 30 % Aer Acr 30g，水溶后定容至100ml，过滤，冰箱中贮存备用。
( 4 ) 1 % Bis Bis 1g ，水溶后定容至100ml，过滤，冰箱中贮存。
( 5）分离胶缓冲液（1.5mol / L Tris , pH8.7 ) Ths 15.17g，适量水溶解，然后用lmol
/ L HCI 调pH 值至8.7，定容至100ml 。
( 6）浓缩胶缓冲液（0.5mol / L Tris-Hcl , pH6.8 ) Tris 6.06g ，适量水溶解，然后用 lmol / L HCI 调pH 值至6.8，定容至l00ml。
( 7 ) 10 % SDS SDS 1g，加水10ml 溶解。
( 8 ) 10％过硫酸铵1g 过硫酸铵，加水10ml 溶解，现用现配，冰箱中最多可贮存一周。
( 9 ) TEMED（四甲基乙二胺）4℃，棕色瓶中贮存。
( 10）样品缓冲液（pH8.0 ) Tris 6.05g，甘油50ml，巯基乙醇25ml，溴酚蓝0.5g ,SDS l0g，溶于水，用HCI 调PH 至8.0，定容至500ml。
( 11）脱色液 甲醇：乙酸：水＝5 : 1 : 5（体积比）
( 12）染色液（0.25％考马斯亮蓝R250）1.00g 考马斯亮蓝R250，用脱色液400ml溶解，过滤备用。
( 13）低分子质量标准蛋白溶液，包括溶菌酶（MW = 14 400Da）大豆胰蛋白酶抑制剂（21 5000）、碳酸酐酶（310000）、卵白蛋白（450000）、牛血清白蛋白 (66 2000）、磷酸化酶B (92 5000）。用样品缓冲液配成2mg / ml 溶液，在沸水浴中加热3-4min，冷却后使用。