应用EL

相关专题

 

　　IL-1是一种十分重要的免疫 调节因子，同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤的重要的内源性致热原和炎症介质。目前IL-1 检测方法有多种，主要包括：小鼠胸腺细胞法，黑素瘤细胞增殖抑制法，纤维母细胞法、T淋巴细胞系法以及EBV转化B细胞法等。
　　㈠ 原理：小鼠胸腺瘤细胞系EL4的某些亚克隆 细胞表面具有高密度IL-1受体，在IL-1诱导下产生高水平的IL-2，通过用IL-2依赖株CTLL-2检测IL-2的生物学活性，从而反映检测样品中IL-1的水平。
　　㈡ 操作步骤：
　　　 1. 用EL４细胞两步法检测IL-1活性：
　　　　　　　　收集处于对数生长期的EL４细胞
　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　洗涤后，用1％FCS RPMI1640重悬细胞，并
　　　　　　　　　　　调整细胞浓度2×10６/ml，
　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　加处96孔板中，100μl/孔
　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β，100μl/孔，
　　　　　　　　　　　同时设1％FCS RPMI 1640对照
　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　5％CO,37℃培养18～24小时
　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　按终稀释度为1∶10～20转入另一块96孔板中
　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　用CTLL-2 检测IL-2活性、检测方法见"IL-2检测"

2. 用EL4细胞一步法检测IL-1活性
　　　　　　　　用5％FCS RPMI 1640调整
　　　　　　　　EL4细胞浓度至2×10５/ml，CTTL-2浓度至4×10５/ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　　加入96孔板中，两种细胞各加50μl/孔
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　　加入不同稀释度的IL-1或待测样品，同
　　　　　　　　　　　　　时设EL４和CTLL-2细胞对照
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　　　置5％CO２,37℃培养24～28小时后加入
　　　　　　　　３H-TdR,0.5μci/50μl/孔,继续培养6～8小时
　　　　　　　　　　　　　　　　　 ↓
收集样品，β计数

　　㈢ 试剂和器材
　　 1. EL４细胞
　　 2. CTLL-2细胞
　　 3. 标准rIL-1。
　　 4. ３H-TdR、POPOP、PPO、二甲苯。
　　 5. 玻璃纤维滤纸，细胞收集仪。
　　 6. β计数仪
　　 7. 96孔板，无菌吸管，滴管、试管及加样器头。
　　 8. FCS,RPMI 1640,CO２培养箱等。
　　㈣ 注意事项：
　　1. 在一步法检测IL-1时，其EL４细胞浓度不宜超过1×10４/孔，血清终浓度应＜5％。
　　2. 在二步法检测IL-1时，其EL４细胞浓度在2×10５/孔时，犉d转移上清稀释度不宜低于1∶8,其诱导时间应12～24小时间为佳。诱导血清浓度应≤1％。
　　3. 在检测经诱导的上清中IL-1时，应避免使用A23187，TPA和ConA等较强的能诱导EL４细胞产生IL-2的诱导剂来刺激IL-1的产生。