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免疫共沉淀原理及试剂配制方法

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一 原理:

IP是利用抗原 蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原 结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次,要注意溶解抗原 的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原 的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原 ,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。

二 准备:

器械

微量高速冷冻离心机

移液枪

旋转盘

电泳设备

vortex震荡器

液氮及组织粉碎器

试剂

细胞或组织

蛋白定量kit

SDS电泳试剂

抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)

PBS

NaN3

proteinA sapharose

试剂配制

抗原蛋白溶解缓冲液

1.RIPA缓冲液 (最终浓度)

1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)

5MNacl 15ml (150mM)

0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)

20%TritonX-100 25ml (1%)

10% DOC 50ml (1%)

10%SDS 5ml ( o.1%)

TLCK 18.5mg (0.1mM)

TPCK 35mg (0.2mM)

DDW 395ml

toal 500ml

另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)

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